第1章电化学传感器研究技术

1.1电化学传感器概述

1.1.1电化学传感器简介

电化学是研究电和化学反应相互关系的科学。电和化学反应相互作用可通过电池来完成，也可利用高压静电放电来实现，二者统称电化学，后者为电化学的一个分支，称为放电化学。电化学传感器是基于待测物的电化学性质并将待测物化学量转变成电学量进行传感检测的一种传感器。它将电化学分析方法与传感器技术相结合，发展出一种具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的传感器，具有灵敏度高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、价格低廉且可以实现连续现场检测等特点。

1.1.2电化学传感器工作原理

典型的电化学生物传感器由两部分组成［1］：一部分是能够选择性识别被测物质的感受器，即生物敏感元件，由对被测物质具有高选择性分子识别功能的膜构成；另一部分是信号转换元件，即将信号从一种形式转换成另一种形式的传感元件。生物体内存在许多分子识别功能物质(如酶、抗体、动植物细胞、动植物组织等)，能选择性地识别特定的物质。生物传感器正是巧妙地利用生物体分子固有的识别性能，将其固定在适当的载体(人造生物膜)上，形成生物功能膜，将生物分子识别反应产生的各种物理化学变化(如pH变化、电子转移、质量变化、热量转移、气体或特殊离子的消耗和释放等)转换成可测量的信号，然后再通过放大、整波、数字化或其他处理，最终通过仪表或显示终端记录结果，从而达到分析检测的目的［2］。图1-1为电化学传感器工作原理示意图。图1-1电化学传感器工作原理

1.2电化学检测技术

1.2.1电位扫描法在所有研究电极过程的方法中，电位扫描法的应用最为广泛。其工作原理主要是在工作电极上连续施加不同的电位，它们反映溶液中电活性物质的氧化还原(法拉第反应)，或者由于施加电位和电容电流(双电层电容)导致的物质吸附。在线性扫描伏安中，电位扫描是单向的，扫描方向可以是氧化或还原，扫描速率可以是任意值［3］。

1.2.2循环伏安法循环伏安法(CV)是进行电化学定量反应运用最广泛的技术。CV可以快速提供关于氧化还原过程的热力学信息、不同电子传递反应的动力学信息和成对的化学反应或吸附过程信息［4］。由于它可以快速给出电活性物质的氧化还原电位，以及评估基质对于氧化还原过程的影响，因此常常是电分析研究进行的及时个实验。在研究氧化还原电对时可以快速地扫描电极电位，一旦确定峰位置，则可以研究峰电位与扫描速率之间的关系并进行定性(图1-2)。图1-2(a)循环伏安法实验的电位-时间曲线；(b)电位-电流曲线

重复的三角形电位激发信号使得工作电极上的电位在两个设定的值(V1、V2)之间来回扫描，为了得到循环伏安图，在电位扫描期间同时测定工作电极的电流。循环伏安法中电压扫描的过程包括阳极、阴极两个方向，因此可以从循环伏安图中的氧化峰和还原峰的峰高，以及峰形的对称性判断反应的可逆程度。如果反应是可逆的，则曲线上下是对称的；如果不可逆，则不对称。循环伏安图最重要的参数是氧化还原峰的峰电位(Epc、Epa)和峰电流(ipc、ipa)。对于一个可逆反应来说，还原电位E0公式为E0=(Epa+Epc)/2峰距为

因此，对于一个可逆的氧化还原反应来说，在25℃下ΔEp=0.0592/n V或者转移一个电子，电位差为60mV。然而实际情况中，由于一些外在因素如电解池电阻等的干扰，很难得到这样一个理想的状态。

作为电化学最古老的技术，CV被广泛研究。它是一种很有用的电化学研究方法，可以用于研究液体-电极接触处吸附现象和分析物吸附解析等。由于其快速性，灵敏度便退而求其次。然而它却不能将线性扫描波形、背景充电电流和电活性物质产生的电流区分开，因此该法很少用于定量分析。

1.2.3电化学阻抗谱电化学阻抗谱(EIS)或交流阻抗(AC阻抗)是施加一种周期性的小振幅的正弦波电位(电流)作为扰动信号的电化学测量方法［5］。小幅度的扰动信号，一方面可以避免对体系的干扰，另一方面也可以使得扰动与体系响应之间成近似的线性关系，从而简化数据处理［6］。

电化学阻抗谱是一种观察生物分子相互反应动力学的理想工具。最常用的评估电化学阻抗谱数据的是Nyquist和Bode图［7］(图1-3)。图1-3电化学阻抗谱的Nyquist和Bode图

为了表征表面特性，通常用等效电路拟合实验数据得到必要的信息。由于电化学检测池是一个复杂的系统，很多线路模型可以拟合实验数据。最简单常用的称为Randles模型，由电解质溶液电阻(RS)、双电层电容(Cdl)、电荷转移电阻(Rct)和Warburg 阻抗(ZW)组成［8］(图1-4)。Randles模型是其他一切复杂模式的原型。 Randles检测池的Nyquist图通常是一个半圆。溶液阻抗是高频区截距的实轴值，通常是半圆的起点值；低频区实轴值是电荷转移阻抗和溶液电阻总和；半圆的直径等于电荷转移阻抗。实际中Nyquist图通常是由高频区一个圆心在实轴的半圆和低频区的一个直线组成，半圆对应电子转移的受阻情况，直线对应体系扩散的受阻过程。图1-4电化学阻抗的等效电路

近几年，电化学阻抗谱快速兴起。因为它们可以得出、验证和定量相关的实验阻抗。然而，最困难的问题是电极过程的建模。需要研究各种不同的反应和界面(腐蚀、涂料、导电聚合物、电池和燃料电池等)，目前主要的研究在于弄清并分析这些过程。

电化学阻抗谱最初应用于检测双电层电容，现在被用于鉴定电极过程和复杂的界面。应强调的是电化学阻抗谱并不能给出所有的解释，在阐明界面过程时，它与其他技术是一个互补的关系。电容只与工作电极有关，电阻包括电极过程和溶液的阻碍作用，有时也存在电容、电阻并联的情况。然而，这项技术的缺点在于它是测量整个电解池的阻抗，其实研究电极过程只与其中一支电极的性质有关。因此通过辅助电极降低其他不必要部分的干扰是值得被探索的。

1.2.4差示脉冲伏安法

差示脉冲伏安法是检测痕量有机和无机物质有用的技术。这项技术与常规脉冲伏安相同的是电位扫描伴随一系列脉冲，不同的是在小振幅(10～100mV)下，每个固定的电位脉冲又与基础电位小幅度的变化重叠。

得到的差示脉冲伏安图包括峰电位和峰电流，峰电位与分析物的性质有关，峰电流与相应分析物的浓度成一定的比例。这样的定量方法不仅取决于相应的峰电位，也与峰宽有关。差示脉冲得到的峰形可以用来区别氧化还原电位相似的两种物质。响应得到的峰形相对于平坦的背景电流，使得这项技术在分析混合物时显得尤为重要。

脉冲振幅和电位扫描速率的选择经常需要权衡灵敏度、分辨率和速度。例如，大的脉冲振幅则得到大的宽峰。常见的脉冲振幅在25～50mV，扫描速率5mV/s。相比于可逆系统，不可逆氧化还原系统得到的电流峰宽而低。因此，这项技术也可以提供关于分析物的化学形态的信息，如氧化态、络合态等。

1.2.5计时电流法

计时电流法是一种研究电极过程动力学的电化学分析法和技术。其原理是在电解池上突然施加一个恒定的、足够使溶液中的某种电活性物质发生氧化还原反应的电位，然后记录电流和时间的变化。在整个过程中，溶液电阻向双电层瞬间充电表现为电流的突跃，然后由于双电层充电电流随着双电层电位差的增加而逐渐减小，电流开始按指数规律减小，这一电流衰减的快慢与电极的时间常数有关，当电流衰减到水平段，双电层充电基本结束，得到的稳定电流便是电极反应的电流。

计时电流法常用于电化学中电子转移动力学的研究。计时电流法工作电压的选择通常是通过循环伏安图来确定的，即取循环伏安图中的峰电流或在峰电压附近找一些电压点，用I-T的方法分别测同一标本，描绘出一个电压和电流的曲线，选取电流较大的电压。目前，电化学免疫传感器在引入电活性物质后，采用计时电流法作为检测手段的研究还是比较多的。

近年来还有采用两次电位突跃的方法，称为双电位阶的计时电流法。即首先突然加一电位，使电极发生反应，经很短时间的电解后，又跃回到原来的电位或另一电位处，此时原先的电极反应产物又转变为它的原始状态，从而可以在I-T曲线上更好地观察动力学的反应过程；并从科特雷耳方程出发，考虑反应速率，进行数学推导和作图，求出反应速率常数。

1.3电化学传感器的修饰方法

1.3.1物理吸附

物理吸附是最简单、最快速但可信度低的方法。抗体在基底上可以任意连接方式的形式存在，很难控制结合位点的正确定位。吸附是非特异性的，故生物传感器的性能也不是很好。但是吸附法具有不需化学试剂、不需活化步骤以及清洁步骤少、酶活性影响小等优点。有研究者将葡萄糖氧化酶和葡聚糖衍生物相结合，然后吸附在多孔的碳电极上构成酶传感器［9］。由于葡聚糖衍生物可以增强酶的稳定性以及多孔碳的吸附性，故这个传感器具有较好的稳定性和重现性。但与其他固定方法相比，吸附法固定的生物组分寿命较短，易从电极表面脱落，故而未被广泛采用。

1.3.2亲和素-生物素系统生物素与亲和素可以4∶1的比例高效结合，同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物等生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。该法是一种简单却可以将生物分子连接在包被有亲和素的表面的有效方法［10］(图1-5)。图1-5生物素-亲和素结合机制

这种方法的一个较大优点是尽管生物素和亲和素之间的亲和常数很大，但是它们却是非共价结合，这样就方便了多次洗涤和传感器装置的重复使用［11］。此法最重要的缺点是所用试剂昂贵。

1.3.3自组装单分子膜

自组装单分子层是将金平板浸渍在含合适表面活性剂的高纯试剂中得到的。它的原理是在未被氧化的金电极表面通过烷基化试剂的作用形成强的金属硫醇键，然后另一端的自由羧酸盐基团可以与抗原或抗体相连而不破坏其活性。最常用的方法是将金浸渍在二硫化物或硫醇的乙醇溶液中［12］。形成的单分子膜的密实度和厚度取决于含硫原子的分子。用于形成单分子自组装膜的一个重要组分是硫醇。它组装的时间与硫醇的烷基链的长短有关，一般浓度高则需要的时间短。通常情况下，自组装膜可以覆盖整个金电极的表面，但是针孔或缺陷则会导致硫醇残基的氧化，从而使金-硫键氧化断裂，或者成膜分子倒伏脱落，进而影响生物分子的固定(图1-6)。图1-6自组装膜法在金电极表面固定抗体的过程

在单分子层形成后，生物分子与硫醇的另一端相连。为了得到最合适的定向和提高传感器的性能，需要对生物分子进行的了解，然后采用不同形式的化学修饰和活化［13］。由于基于自组装膜的免疫传感器具有很高的稳定性，因此其被广泛地运用［14，15］。相比前两种方法，自组装单层膜在检测的灵敏度和可重复性方面有了很大的提高。 ……