章 绪论

节 工业微生物育种在生物发酵产业中的地位

工业微生物菌种选育在生物发酵产业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。现酵工业之所以如此迅猛发展，除了发酵工艺改进和发酵设备更新之外，更重要的是由于进行了菌种的选育及其改良，为发酵工艺提供了人类需要的各种类型的突变菌株，从而使抗生素、酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、核苷酸、激素、色素、生物碱、不饱和脂肪酸以及其他生物活性物质等产品的产量成倍，甚至成千倍地增长，同时产品的质量也不断提高。因此，工业微生物育种对于提高生物发酵产业产品的产量和质量，进一步开发利用微生物资源，增加生物发酵产业产品的品种具有重大意义。

用于工业生产的微生物菌种要具有以下特性。

1) 在遗传上必须是稳定的。

2) 易于产生许多营养细胞、孢子或其他繁殖体。

3) 必须是纯种，不应带其他杂菌及噬菌体。

4) 种子的生长必须旺盛、迅速。

5) 产生所需要的产物时间短。

6) 比较容易分离提纯。

7) 有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。

8) 能保持较长的良好经济性能。

9) 菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。

10) 在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。

具备以上条件的菌株，才能保障发酵产品的产量和质量，这是发酵工业的目的和要求。野生型菌株是不可能具备上述条件的，必须通过对野生型菌株的选育才能实现。发酵工业为人们提供了各种各样的发酵产品，而工业微生物育种为发酵工业的上述贡献奠定了必不可少的基础。

第二节 工业微生物育种的进展

工业微生物育种，无论从自然变异中选择或是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的基础上。遗传和变异是生物界生命活动的基本属性之一。没有变异，生物界就失去进化的素材；而没有遗传，变异也无法积累。同样，就优良菌株的选育来讲，没有变异就没有选择的素材；没有遗传，选到的优良性状也不能进行培育。由此可见，工业微生物育种学是建立在微生物遗传学基础上，而两者是相辅相成的。

微生物本身，在漫长的进化过程中，逐渐达到适合于它的生存和繁衍的水平。野生型微生物经自然选择，能适应它的周围环境，能适应同其他物种的竞争，但却不能按照人的意志生产人们需要的物质。因此，从人类的利益出发，必须对工业微生物菌种进行改良，使之产生数量远远超出微生物本身需要的物质，或者不是它正常产生的新物质。

对工业微生物菌种进行有目的的改良，是在有关微生物遗传学知识被人们了解并掌握之后才成为可能的。同时，这种改良涉及多学科领域。

1927年，人们发现了X射线诱发突变。1945年后，各种具有诱变能力的辐射和化学诱变剂的发现，为这种改良提供了非常有用的工具。通过诱变和筛选的"选择"，不仅在提高现有产品的发酵单位上发挥了巨大作用，而且在当前多种新发酵产品的改进方面也具有很大潜力。通过对诱变作用和DNA修复机制的深入了解，可以设计出所希望的突变型的方案。对基因表达和代谢途径调控机制的进一步阐明，可以设计出使所需要的突变特性得以充分表达的筛选条件。自动仪表装置和微机的应用，则可使单位时间内获得分离的菌株数量大大增加。这些技术的综合应用，使获得优良菌株的概率大为提高。

工业微生物育种技术的发展大致经历如下阶段。

随着微生物学的发展，特别是发明微生物纯种培养法之后，开始了微生物纯种的自然选育，对工业微生物育种有很大的影响。当时，在酒精发酵中，推广了自然选育的纯系良种，扭转了酒精生产不稳定的现象。这是早应用微生物遗传学原理于微生物育种实践而提高发酵产物水平的一个成功实例。自然选育方法虽已沿用多年，迄今仍是工业微生物育种的手段之一。

由于自然突变频率低，单纯依赖自然界存在的微生物群体来进行的自然选育无疑有很大局限性。继而进行了人工诱变选育，取得了很大效果。

20世纪40年代初，Beadle和Tatum采用X射线和紫外线等辐射因子来诱变红色面包霉等，获得了各种代谢障碍的变株，并于1941年提出"一个基因一种酶"的学说，阐述基因与酶功能的直接关系，使遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进了工业微生物育种技术的发展。

诱变育种是以人工诱变基因突变为基础的，过去是工业微生物育种的主要方法，至今仍是世界各国行之有效的重要方法，尤其发酵工业中的各种优良高产菌株绝大部分都是以诱变育种方法获得的。例如，抗生素生产中的青霉素产生菌特异青霉(Penicillium notatum)是1929年英国的Flemirlg发现的。当时表层培养只有1~2U/ml，而1943年美国北部地区研究所实验室分离出产黄青霉(Pen.chrysogenum)NRRL9551同时伴以沉没培养成功，则达到20U/ml，在此基础上，经过40多年的诱变育种，到目前已达80000U/ml以上，比原始菌株的产量提高了上千倍。至于其他抗生素品种，如链霉素、土霉素、四环素、红霉素及灰黄霉素等，都由原来的几十单位提高到目前的几万单位。

除抗生素外，其他许多重要发酵产品也都由于进行了有效的菌种选育工作，在产量和质量上都取得明显的提高，其主要手段也都是诱变育种。

但是，某一菌株长期使用诱变剂处理之后，除产生诱变剂"疲劳效应"外，还会引起菌种生长周期的延长、孢子量减少、代谢减慢等，这对发酵工艺的控制是不利的。而杂交育种可以作为育种的另一手段，其成功不仅表现在种内杂交上，而且在种间杂交以至属间杂交都取得令人满意的结果。

杂交育种的主要目的是把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的上述缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的手段之一。当然，杂交育种也应当建立在诱变育种的基础上，没有诱变育种，杂交菌株的产量是难以继续提高的。

代谢控制育种以20世纪50年代末谷氨酸发酵取得成功使发酵工业进入第三转折期——代谢控制发酵时期，并在其后的年代里得到飞跃的发展。

代谢控制育种活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成和累积。代谢控制育种的崛起标志着诱变育种发展到理性阶段，导致了氨基酸、核苷酸及某些次级代谢产物的高产菌株大批地投入生产。

随着基因工程在工业微生物菌种选育中的应用，世界上以基因工程方法创造的各种工程菌不计其数，实现了人为的菌种选育，一切可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，这是一种的育种技术。

基因工程菌的构建和应用，已在多方面显示出其巨大的生命力。通过基因工程的方法生产药物——已获得包括治疗用药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等多种获得上市的品种；通过基因工程方法提高菌株生产能力——已获得包括氨基酸类、工业用酶制剂及头孢霉素C在内的工程菌；通过基因工程方法改造传统发酵工艺——如氧传递有关的血红蛋白基因克隆到远青链霉菌，降低了对氧的敏感性；通过基因工程方法提高菌种抗性等。以上诸多类型的基因工程菌构建，使工业微生物育种突破了传统的、经典的育种模式，在工业微生物育种中展示了极为光明的前景。

基因组改组(genome shuffing)是一种细胞定向进化技术。2002年Zhang等在Nature上首次发表了微生物基因组改组育种报道。基因组改组是多亲本微生物之间发生重组，先用诱发突变或点突变技术产生复杂子代组合库，再利用改组技术将有利性状组合拼接，快速进化目标菌的一种选育微生物的新方法。

基因组改组技术巧妙地模拟和发展了自然进化过程，以分子进化为核心，用工程学原理加以人工设计，在实验室实现微生物全细胞快速定向进化，仅需1~2年就可完成自然界数百万年才能达到的进化目标，使得人们能够在较短的时间内获得性状大幅度改良的正向突变的目标菌株，成为微生物育种的前沿技术。

分子定向进化(directed molecular evolution)是一种DNA水平的分子定向进化技术。20世纪90年代中期美国Arnold和Stemmer首先报道了蛋白质(酶)分子改造成功的例子，从此拉开了酶蛋白分子定向进化育种的序幕。分子定向进化属于蛋白质(酶)非理性设计的主要范畴，它不需要了解蛋白质的空间结构和催化机制，在实验室中人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外进行酶蛋白基因的改造，并定向筛选出所需特性的突变蛋白。这样就能在较短时间内完成漫长的自然进化过程，甚至可以在几个月或几周的时间内创造出优化的酶蛋白，而在自然的进化过程中，要得到这个结果需要几千万年之久。

高通量筛选(high-throughput screening)是微生物育种技术的重要组成部分，在工业微生物育种过程中，无论是传统的诱变育种、杂交育种、基因组改组育种、现代基因工程育种及分子定向进化育种等，建库后，都要对文库进行筛选。而文库的库容量很大，各个样品的质量参差不齐，具有很大的性。使用传统零敲碎打的筛选方法，筛选量低，概率小，工作量大，要耗费大量的人力、物力。在这种背景下，高通量筛选技术孕育而生。

高通量筛选技术的核心，首先必须根据目的样品的特性，开发出合适的筛选模型，将样品的这些特性转化成可以用摄像头和计算机传感器识别的光信号或者电信号。此外，要有自动化或者自动化的实验操作系统，能够进行移液、接种、清洗等设备操作。而且必须具备以下特点：具有在高洁净度下工作的能力，不引起污染，可多通道一次性进行多组操作，操作速度快，具有良好的软件和硬件兼容性，能与监测设备对接，实验数据可以在多种软件平台上进行分析，能使用各种通用型规格的耗材。

随着工业微生物育种技术的不断创新，尤其分子育种的手段与方法有了崭新的进展，极大地丰富了工业微生物育种的内容。

在工业微生物生产菌种基因的表达系统方面，除了早采用的原核表达系统和随后采用的酵母表达系统外，还实现了丝状真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统，为工业微生物工程菌的构建创造了创新性的技术基础。

为提高工业微生物生产菌株的产量，重组载体诱变方法已得以实现，其中质粒直接诱变可通过化学诱变剂与质粒反应时间的长短来控制突变率，筛选目的突变菌株已有成功实例。

基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生物学方法，它具有定位性强、插入基因随染色体DNA稳定遗传、操作方便等优点。它为定向改造工业微生物品种提供了重要的技术支撑。笔者在阐明芳香族氨基酸代谢途径的基础上，通过敲除L-色氨酸菌株的tyrA基因获得了酪氨酸营养缺陷型菌株，应用这种营养缺陷型，可使代谢支路的中间体预苯酸不流向酪氨酸生成的方向，使色氨酸的合成有充足的原料。发酵试验结果显示：工程菌的发酵液中没有酪氨酸的存在，同时L-色氨酸的产量较原始菌株提高近1倍，同样，该技术也在L-苯丙氨酸的工程菌构建中取得成功。

全局转录机器工程育种是一种通过引入全局转录扰动来获得多尺度细胞表型突变库的新方法，可以快速、高效地获得性能显著提升的细胞表型重要新技术。

工业微生物高密度培养，又称高细胞密度发酵技术，是在传统发酵技术上改进的发酵技术，利用一定的培养技术和装置，极大地改进了发酵工艺，使菌体密度较普通培养有显著提高，增加工程菌对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵密度，终提高产物的比生产率，不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高市场竞争力。

工业微生物工程菌构建成功之后，关键还在于如何在特定的装备条件下，使其目的产物高效表达化，其中工业微生物工程菌的培养基优化是使该工程菌株高产性状及其他优良特性高效表达的重要发酵技术，除传统的正交试验优化方法外，均匀实验设计优化方法、响