第1章概论

1.1色谱分析法的历史为了弄清楚混合物中的各组分是何种物质及含量是多少，可以采用的方法之一是先将各组分分离，然后对已分离的组分进行测定，色谱分析法就属于这种方法。色谱分析法的原理可以简述为： 被分离的各组分是在两相之间反复进行分配的，其中一相静止不动，称为固定相，另一相是携带被分离组分流过固定相的流体，称为流动相。被分离组分与流动相和固定相都可能发生作用，但被分离的各组分的结构和性质不同，决定了它们与流动相和固定相之间的作用力也不同，导致各组分在固定相与流动相之间的分配系数有差异，经过反复多次的分配，随流动相向前移动，各组分运动的速度不同，彼此分离。虽然关于色谱法的创立与起源在说法上略有不一，但人们基本上认为俄国植物学家茨维特(M.S.Tswett)是色谱法的创始人。因为他从1901年起研究用所谓“色谱法”分离、提纯植物色素。他在1903年3月21日于华沙自然科学学会生物学会会议上，提出题目为《一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用》论文，叙述了应用吸附剂分离植物色素的新方法。他将叶绿素的石油醚抽提液倒入装有碳酸钙吸附剂的玻璃柱管上端，然后用石油醚进行淋洗，结果不同色素按吸附顺序在管内形成相应的彩色环带，就像光谱一样。他在1906年发表的另一篇文章中，命名这些色带为色谱图，称此方法为色谱法； 在1907年于德国生物学会会议上，展示过有色带的柱管和提纯的植物色素溶液。英国人马丁(A.J.P.Martin)与辛格(R.L.M.Synge)在1941年首次提出液液色谱法，使用装在粗柱管中的粗粒度填料，流动相种类少且只在重力的作用下流过固定相，又没有高性能的检测器，因此柱效及检测灵敏度均较低。液液色谱法在此后较长的一段时间内无显著改善，即现在所说的经典液相色谱法。1952年马丁与辛格又研究了在惰性载体表面上涂渍一层均匀的有机化合物液膜，以此作固定相，并以气体作流动相，创立了气相色谱法中应用极为广泛的气液色谱法。马丁首次应用该方法成功地分离了脂肪酸混合物。1956年马丁提出使用小口径(0.2mm)色谱柱的建议。1957年美国学者Golay首先应用小口径毛细管进行色谱分离试验，获得了高于填充柱的分辨率和柱效能，并从理论上加以初步论述。1959年Porath和Flodin提出了具有化学惰性的多孔凝胶作为固定相的空间排阻色谱法，根据固定相孔隙尺寸的不同而具有不同的选择性渗透能力，对分子质量及分子尺寸不同的组分具有选择性，适合测定聚合物的分子质量分布。1970年以后逐渐发展了高效液相色谱法以及各种模式、多种高性能的检测器和联用手段，使液相色谱技术逐步产生了实质性的改进和极为广泛的应用。1975年H.Small及其合作者发表了及时篇离子色谱论文，同年商品仪器问世。初期，离子色谱主要是用于阴离子的分析，目前已经成为在无机和有机阴、阳离子混合物分析中起重要作用的分析技术。1979年弹性石英毛细管色谱柱商品化，使气相色谱的应用再次发生了飞跃。虽然毛细管电泳以及后来发展的各种模式的相关技术可以上溯到20世纪60年代甚至50年代，但是迅速发展还是在80年代。1981年，Jorgenson和Lukacs使用75μm直径的熔融石英毛细管做CZE(毛细管区带电泳)，利用电迁移进样和荧光检测，在30kV的电压下获得了4×105塔板/m的柱效，成为毛细管电泳发展史上的里程碑。之后发展了胶束电动色谱、毛细管凝胶色谱、毛细管电色谱等模式。主要应用领域是蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析等。我国色谱研究工作起步于1954年，由中国科学院大连化学物理研究所做出首张色谱图，并进行了早期的色谱理论和技术研究工作。半个世纪以来，全国范围内的多家高校、科研院所、仪器厂商等单位相继开展了众多的色谱法研究和应用工作。近年来，国际性、全国性、省级及区域性的各种色谱学术会议频繁举行，我国色谱工作者在色谱的基础理论和应用研究方面已经取得一些接近国际先进水平的成果，在仪器制造方面近年来积极引进、学习和吸收国外的先进技术，亦取得了显著的成就。1.2色谱法的分类色谱法有多种类型，从不同角度出发，有各种色谱分类法。1.2.1按流动相和固定相的物态分类按流动相的状态，色谱法可分为气相色谱法(gas chromatography,GC,流动相为气体)、液相色谱法(liquid chromatography,LC,流动相为液体)和超临界流体色谱法； 按固定相的状态，又可分为气固色谱法、气液色谱法、液固色谱法和液液色谱法等，见表11。

表11按流动相和固定相的物态分类的色谱法

种类流动相固定相固体液体

气相色谱法气体气固吸附色谱法气液分配色谱法液相色谱法液体液固吸附色谱法液液分配色谱法超临界流体色谱法超临界流体

固定相为固体吸附剂，流动相为气体时，称为气固吸附色谱法。固定相是液体，而流动相是气体时，称为气液分配色谱。这时，该液体固定相附着在一种惰性的担体上(如硅藻土、玻璃微球等)，装填到色谱柱中，起分配作用的是这层液体，因此这种色谱法叫气液色谱。超临界流体色谱技术采用了近乎临界状态的稠密气体为流动相。这种状态下，流动相对多种物质具有良好的溶解性，因此许多在气相色谱过程中不稳定的化合物，以及在液相色谱上难以分离的化合物可以采用超临界流体色谱技术分析。这种技术介乎液相色谱和气相色谱之间，但不能取代其他种类的色谱技术。1.2.2按分离的原理分类利用组分在流动相和固定相之间的分离原理不同来分类，可以将色谱法分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法、离子色谱法等10余种方法。吸附色谱法是利用吸附剂对样品的吸附性能不同达到分离的。它可分为气固吸附色谱和液固吸附色谱。吸附剂是利用表面的性质来吸附化合物的，表面积越大的吸附剂，吸附能力越强。分配色谱法的分离原理是试样组分在固定相和流动相之间的溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。凝胶渗透(体积排阻)色谱法，以凝胶为固定相。它的分离机理与其他色谱法不同。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来分离，而是按分子大小进行分离。1.2.3按固定相使用的方式分类根据固定相在色谱分离系统中使用的方式，可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法。柱色谱是指将固定相放在玻璃、不锈钢、石英等管中，该管子叫做色谱柱，这种色谱法叫柱色谱。如果固定相是用一张纸，并在上面涂以固定液。一般就是在纸上吸上水，成为纸上的固定液。当然要有一定的处理方法，利用纸上吸的水，再用另一种溶剂作冲洗剂。这种方法就叫做纸上层析，也叫纸色谱。将固定相均匀地涂在玻璃或其他材料的平板上，形成一个固定相的薄层，用来进行色谱分离，称为薄层色谱。1.2.4按色谱动力学过程分类根据流动相洗脱的动力学过程不同，可分为冲洗色谱法、顶替色谱法和迎头色谱法等。目前，色谱分析中主要用的是冲洗法，顶替法和迎头法虽然还在用，但是用得很少。冲洗法就是把样品加在固定相上，然后用流动相冲洗。根据吸附能力和分配系数的不同，按次序洗脱出来。分配系数最小的先出来。冲洗剂，或者是气体，或者是液体，是不断加上去的。这是一种最简单的方法。还有一种方法，就是把样品加到固定相上以后，例如把烷烃、烯烃和芳烃的混合样品加到硅胶上，再加入甲醇。由于甲醇的吸附能力较强，它一进去后就在所有的过程中把其他东西往下顶，但是由于芳烃的吸附能力比烯烃强，烯烃的吸附能力又比烷烃强，因此，甲醇首先顶的是芳烃，芳烃下来又顶烯烃。所以经过一段时间以后，流出的次序是： 烷烃走在最前面，烯烃走在中间，芳烃走在，再后面就是甲醇。这就是顶替法。如果不加顶替剂，而是让样品连续地通过色谱柱，首先出来的还是烷烃。因为在柱子所吸附的样品中，烷烃的吸附能力最小，最容易饱和，因此烷烃先出来，接着就是烯烃。因为是连续进样，所以第二个出来的是烷烃和烯烃的混合物，而不是纯烯烃。同样，出来的是烷烃、烯烃和芳烃的混合物，而不是纯芳烃。这就像波浪一样迎头而来，所以叫做迎头法。顶替法和迎头法在气相色谱中现在用得很少，但在生化样品的制备色谱中，仍用得较多。1.2.5按色谱技术分类为提高组分的分离效能和选择性，采取了许多技术措施，根据这些色谱技术的性质不同而形成了多种色谱种类，包括程序升温气相色谱法、反应气相色谱法、裂解气相色谱法、顶空气相色谱法、毛细管气相色谱法、多维气相色谱法、制备色谱法7种方法。程序升温气相色谱法，是沸点范围较宽的试样适宜采用的一种方法。即柱温按预定的加热速度，随时间线性或非线性地增加。升温的速度一般呈线性，即单位时间内上升的温度是恒定的，例如2℃/min，4℃/min，6℃/min等。在较低的初始温度，沸点较低的组分，即最早流出的峰可以得到良好的分离。随柱温增加，较高沸点的组分也能较快地流出，并和低沸点组分一样也能得到分离良好的尖峰。反应气相色谱法是利用适当的化学反应将难挥发试样转化为易挥发的物质，然后以气相色谱法分析。这样使那些原本不适用于气相色谱分析的物质也能进行色谱分析，扩大了色谱法的应用范围。裂解气相色谱法是将分子质量较大的物质在高温下裂解后进行分离检定，已应用于聚合物的分析。同样，使色谱法的应用范围得以延伸。顶空气相色谱法，严格来讲，是一种进样技术。即不直接将样品进入色谱柱，而是将固体或液体样品置于密闭的容器中，在一定的温度下，使气、固或气、液两相达到平衡，然后吸取上端的气体进样，通过平衡气体的分析结果来确定实际样品的组成和含量的分析方法。毛细管气相色谱法是采用高分辨能力的毛细管色谱柱来代替填充柱分离复杂组分的色谱法。虽然毛细管柱每米理论塔板数与填充柱相近，但可以使用50～100m的柱子，而柱压降只相当于4m长的填充柱，总理论塔板数可达10万～30万。毛细管柱气相色谱法是一种高效、快速、高灵敏的分离分析方法。多维气相色谱法，指在使用多柱或多检测器的基础上，还要使用多通阀或通过改变串联双柱前后压力的办法来改变载气在柱内的流向。也就是说，样品可在经过及时次分离后，又通过改变载气流向的办法，使样品全部或部分经过第二柱进行第二次分离或部分从及时柱前反吹出去，从而大大提高了色谱的分离能力。这样，经及时根色谱柱没有得到分离的样品，可通过改变载气流向的办法，使样品进入第二根色谱柱重新进行分离，以得到比单柱系统更多的分离信息。制备色谱法是以色谱技术来分离、制备较大量纯组分的有效方法。在现代科学研究工作中，经常期望采用有效方法获得需要的较高纯度的标准物(色谱纯)，制备色谱法提供了这种可能。1.3色谱分析法的特点与局限性1. 色谱法的特点

1) 选择性好 通过选择对组分有不同作用力的液体、固体作为固定相，在适当的操作温度下，使组分的分配系数有较大差异，从而将物理、化学性质相近的组分分离开，如恒沸混合物、沸点相近的物质、同位素、空间异构体、同分异构体、旋光异构体等。2) 分离效率高，分析速度快 对于气相色谱，由于气体黏度小，用其作为流动相时样品组分在两相之间可很快进行分配； 并且通过盛有固定相管柱的阻力小，即可用较长的色谱柱，使分配系数相差很小的组分，可在较短时间内分离开。对于高效液相色谱，液体流动相在高压泵驱动下能够快速通过粒度非常细的填料，高效并且快速。3) 灵敏度高、样品用量少 使用高灵敏度检测器，可以完成痕量样品的检测。如用热导池检测器可检出微克级的组分； 氢火焰离子化检测器可检测出百万分之几的杂质； 电子俘获检测器与火焰光度检测器可检测出十亿分之几的杂质。4) 应用范围广 气相色谱在柱温度条件下，可分析有一定蒸气压且热稳定性好的样品，可直接进样分析气体和易于挥发的有机物； 对于不易挥发或易分解的物质，可转化成易挥发和热稳定性好的衍生物进行分析； 部分物质可采取热裂解的办法，分析裂解后的产物。高效液相色谱结合多种检测器可直接分析不易挥发或易分解的物质，高沸点物质、高分子或大分子化合物、部分糖类物质，尤其是在药物分析方面应用极为广泛。现在色谱法在分析方面应用的领域主要有石油工业、环境保护、临床化学、药物与药剂、农药、食品、卫生防疫理化检验、司法检验等。2. 色谱法的局限性1) 色谱法本身不能够直接给出定性结果，需要用已知标准物质或将数据与标准数据对比，或与其他方法，如质谱(mass spectrometry,MS)、红外光谱等联用才能获得较的结果。2) 定量测定时需要用标准物质对检测器信号进行修正。3) 对某些异构体、某些固体物质的分析能力较差。1.4色谱图和相关术语1. 色谱图