及时章 数量性状的概念及研究进展

及时节 分子数量遗传学的研究简史

远古时代人类祖先建立了作物栽培和动物驯养方法，实质上就是萌芽状态的对遗传和变异规律的认识及应用。自此以后，人们对遗传和变异的本质提出过种种假说。奥地利科学家孟德尔(Mendel，1822—1884)以豌豆为材料进行研究，1864年提出了遗传因子的分离定律和自由组合定律。35年后，荷兰的德弗里斯(de Vires，1848—1935)、德国的柯伦斯(Correns，1864—1933)、奥地利的柴马克(Eschermak，1871—1962)，分别以月见草、玉米和豌豆为材料，再次证实了孟德尔定律。这三人的论文刊登在1900年出版的《德国植物学会杂志》，标志着遗传学的诞生。在细胞遗传学时期(1900~1952)，遗传学研究的主要特征是从个体水平进展到细胞水平，并开始从细胞水平迈向分子水平，在各个领域都获得了突破性进展。1953年沃森(Watson)和克里克(Crick)提出了DNA双螺旋结构模型，标志着遗传学及整个生物学进入分子水平的新时代，即现代分子遗传学时代(1953~现在)。21世纪初人类基因组计划提前完成，遗传学进入了"基因组后研究"时代，面临新的挑战和使命。

在遗传学的发展历程中，质量性状的描述和解析是遗传发展的主要内容。然而，作物的许多重要性状，如产量、品质和抗逆性等性状大多数是数量性状。在遗传学发展的起始阶段，人们就力图阐明这些数量性状的遗传规律，并应用于生产实践。19世纪末，孟德尔遗传学与数学相结合形成了群体遗传学。20世纪20年代，Fisher将群体遗传学与生物统计学相结合，开创了数量遗传学(quantitative genetics)(Fisher，1918)。数量遗传学是以数量性状(quantitative trait)为研究对象的遗传学分支学科，它作为育种的理论基础已经发展了近百年(孙祎振，2006)。

1980年Bostein首次提出利用DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)作为遗传标记，这种分子水平的标记具有多态性高、数量多、基因组覆盖面大、限制因素少、检测方便等优点，是形态学标记、细胞学标记和生化标记无法比拟的。分子标记是研究生物性状，尤其是数量性状遗传变异的很好工具，因而引起了广大遗传育种工作者的极大兴趣，不断发掘出新的分子遗传标记，如RAPD、AFLP、SSCP、SNP等，用这些分子标记解析数量性状基因(QTL)，带来了极大的方便，并具有实用性。因此，分子遗传学和数量遗传学相结合，开创了分子数量遗传学。分子数量遗传学将是21世纪数量遗传学的主要研究方向，对QTL检测与定位、标记辅助选择、标记辅助导入等研究和培育突破性作物新育种(superior variety)都会带来革命性的变化。最典型的例子是QTL定位开发的分子标记，已开始应用于分子标记辅助选择育种，有效地提高了主效数量遗传位点的跟踪和利用效率，加快了种质创新和品种选育的进程。在分子标记辅助选择育种的基础上，2003年比利时科学家Peleman和Van der Voort又提出了分子设计育种(breeding by design)的概念及方法，可以极大地提高育种水平，将成为未来作物遗传改良的主流技术。

第二节 数量性状的概念和遗传特点

数量性状(quantitative character)是指在一个群体内的各个个体间表现为连续变异的性状，如动植物的高度或长度等。数量性状易受环境的影响，在一个群体内各个个体的差异一般呈连续的正态分布，不像质量性状一样在个体间明确地分组。

数量性状有特殊的遗传特点。1909年，瑞典学者H·尼尔松·埃勒提出"多基因学说"以解释数量性状的遗传，认为根据质量性状研究的结果得来的孟德尔定律同样可以用来解释数量性状的遗传，同一数量性状由若干对基因所控制；各个基因对于性状的效应都很微小，而且大致相等。1941年，英国数量遗传学家K·马瑟把这类控制数量性状的基因称为微效基因，相应地把效应显著而数量较少的控制质量性状的基因称为主效基因；认为控制同一数量性状的微效基因的作用一般是累加性的；控制数量性状的等位基因间一般没有明显的显隐性关系。这就是描述数量性状遗传控制的多基因假说，其要点是：①数量性状受许多彼此独立的基因作用，每个基因作用微小，但仍符合孟德尔遗传定律；②各基因的效应相等；③各个等位基因表现为不显性或无显性，或增效和减效作用；④各基因的作用是累加性的。

现代遗传学对多基因假说有了进一步的发展，认为数量性状可以由少数效应较大的主基因控制，也可由数目较多、效应较小的微效多基因所控制；各个微效基因的遗传效应值不尽相等，效应的类型包括等位基因的加性效应、显性效应，以及非等位基因间的上位性效应，还包括这些基因主效应与环境的互作效应。

数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)是控制数量性状的基因在基因组中的位置，包括基因座对数量性状的作用方式和效应值。QTL与连续变化的数量性状表型有密切关系，目前常利用DNA分子标记技术对这些区域进行有效的定位和效应估算。

第三节 数量性状基因研究的工具

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面(Aneja et al.，2012)。

分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或同工酶蛋白等生化标记；狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DN段。

一、分子标记的种类

分子标记主要包括基于分子杂交的分子标记、基于PCR的分子标记、基于限制酶酶切和PCR的DNA标记，以及基于DNA芯片的分子标记，其中目前种类较多、应用广泛的是基于PCR的分子标记技术。

(1)基于分子杂交的分子标记，是利用限制性内切核酸酶酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性，包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和数目可变串联重复多态性(variable number of tandem repeat，VNTR)。

(2)基于PCR技术的分子标记目前应用较多。其中，随机引物的PCR标记，所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的DNA区域事先未知。它包括随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)、任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction，AP-PCR)和DNA扩增指纹印记(DNA amplification fingerprinting，DAF)。

此外还有特异引物的PCR标记，指PCR标记所用引物是针对已知序列的DNA区段而设计的，具有特定核苷酸序列(通常为18~24bp)，可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组DNA的特定区域进行多态性分析。它包括序列标志位点(sequence tagged site，STS)、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)、序列特异性扩增区(sequence-characterized amplified region，SCAR)、单引物扩增反应(single primer amplificatipn reaction，SPAR)、DNA单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)和双脱氧化指纹法(dideoxy fingerprint，ddF)等。

(3)基于限制酶酶切和PCR技术的DNA标记，包括扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphism aequences，CAPS)等。

(4)基于DNA 芯片技术的分子标记技术。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等，SNP 标记可区分两个个体遗传物质的差异，被称为第三代DNA分子标记技术。随着DNA芯片技术的发展，SNP标记有望成为最重要、最有效的分子标记技术。

二、分子标记应用领域

分子标记可以应用于诸多领域，基因组作图和基因定位研究是其重要应用领域之一。

(一)遗传多样性分析及种质资源鉴定

遗传多样性反映了不同种群之间或不同个体间的遗传变异。遗传多样性分析为研究物种起源、品种分类、亲本选配和品种保护等提供科学依据，是收集、保护和有效利用种质资源的技术基础，有利于培育出更优良的品种。分子标记广泛存在于基因组，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，能够评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。此外，分子标记技术因其具有较高的多态性，可以更好地应用于种质资源鉴定，是种质资源材料鉴定、种质资源保护的重要手段。

(二)遗传图构建和基因定位研究

遗传图是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。长期以来，各种生物的遗传图几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，图谱分辨率低，图距大，饱和度低，应用价值有限。分子标记种类多、数量大，遗传图上的新标记将不断增加，密度也将越来越高，可以建立起达到预期目标的高密度分子图谱。在高密度图谱下，简单有效的分子标记系统可在基因标记及基因克隆研究中应用。众多实践说明分子标记技术是一个高速、、有效的基因定位方法。

(三)基于图谱克隆基因

图位克隆(map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，1986年首先由英国的Coulson(1986)提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有与目标基因紧密连锁的分子标记和用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置。图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高密度遗传图、大尺寸物理图、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用奠定了基础。

(四)分子标记辅助育种

传统的育种主要依赖于植株的表现型选择。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。分子标记辅助育种(MAS育种)既可以通过与目标基因紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进行选择，也可以利用分子标记对轮回亲本的背景进行选择。获得与重要性状基因链锁的标记，有利于植物分子标记辅助育种的进行，可进一步提高植物改良育种的选择效率，提高新品种的选育速度。其中，目标基因的标记筛选是进行MAS育种的基础。

第四节 数量性状基因(QTL)定位研究进展和展望

一、QTL分析方法

经典的数量遗传学建立在多基因假说基础上，把控制数量性状的基因作为一个整体，重点研究各种遗传效应与遗传方差的分解和估计。分子标记连锁图的出现，可以像研究质量性状基因一样研究数量性状基因，也可以把单个数量性状基因(QTL)定位在染色体上，并估计其遗传效应，这一过程称为QTL作图。

控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座(QTL)。利用分子标记进行遗传连锁分析，可以检测出QTL，即QTL定位(QTL mapping)。QTL的定位必须使用遗传标记，人们通过寻找遗传标记和数量性状之间的联系，将一个或多个QTL定位到位于同一染色体的遗传标记旁，即标记和QTL是连锁的。

QTL定位就是采用类似单基因定位的方法将QTL定位在遗传图上，确定QTL与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及较大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如QTL复合区间作图(CIM)、多区间作图(MIM)、多QTL作图、多性状作图(MTM)等。

二、QTL定位研究进展

分子标记已在玉米、大豆、鸡、猪等动植物育种和生产中有许多应用研究，主要集中在基因定位、辅助育种、疾病治疗等方面的应用研究工作，取得了一些应用成果。当前植物QTL研究的发展主要体现在以下几个方面。

(一)作物QTL定位概况

分子数量遗传学的发展为作物育种赋予了新的活力。数量性状可剖分为若干离散的孟德尔因子所决定的组分，确定其在染色体上的位置及与其他基因的关系。近年来作物QTL定位获得了较大进展。据不统计，截止到2012年底，利用不同分子标记构建的作物遗传图达4200多张(多数为SSR图谱)，涉及形态、产量、品质、抗性等性状。QTL定位涉及的作物包括：粮食作物(水稻、玉米、豆类、小麦等)；经济作物(油菜、大麻、向日葵等)；蔬菜作物(番茄、萝卜、黄瓜、白菜、菊芋、刀豆、芫荽、莴笋、黄花、辣椒等)；果类(苹果、桃、杏、核桃、李子、樱桃、草莓等，野生果类如酸梨、野杏、山樱桃等)；还有一些饲料作物(如紫云英等)。其中，粮食作物的QTL定位占到60%以上。目前小麦的遗传图约180张，多为SSR图谱，涉及形态、产量、品质、抗性等性状(Besnier et al.，2010；Wurschum，2012)。

(二)QTL定位的分子标记发展

近30年来，分子标记技术得到了快速发展，目前DNA分子标记已达四大类几十种，而新的分子标记方法不断出现，除过去和现在常用的RFLP(Devos et al.，1993)、RAPD(Williams，1990)、AFLP(Vos et al.，1995)和SSR(Torada et al.，2006)标记外，近几年应用的相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)以其多态性高、非等位检测、样品信息量大、操作简便、重复稳定、性高和费用低等优点，广泛应用于作物的数量遗传学研究(Li and Quiros，2001；Aneja et al.，2012)。Jaccoud等2001年开发了一种新的分子标记技术，即多样性微阵列技术(diversity arrays technology，DArT)，该技术具有高通量、不需已知序列、自动化程度高等特点，已经被广泛应用于小麦遗传图的构建和基因定位研究。Brookes(1999)和Rafalski(2002)提出的单核苷酸多态性(SNP)是任何生物基因组中最多和最普遍的多态性形式，在构建高密度遗传图、精细定位目标基因和基因克隆等方面，SNP比微卫星标记(SSR)和其他重复序列更有价值。SNP检测与分析技术的飞速发展，特别是与DNA微阵列和芯片技术相结合，使其迅速成为继RFLP和SSR之后最有前途的第三代分子标记。此外，多种技术结合起来，可得到更、更丰富的差异片段，从而在植物基因差异表达、新基因发现、抗逆性分子机理研究等方面发挥更大的作用。

(三)QTL定位方法的发展

用于QTL定位的遗传群体多种多样，用于分子标记的遗传作图群体一般分为两类，一类为暂时性分离群体，包括F2群体、BC等；另一类为加倍单倍体(doubled haploid，DH)和重组自交系(recombinant inbred line，RIL)等长期性分离群体，这类群体的遗传背景复杂，一般认为定位的度有限，在10~30cM的区间(Kearsey and Farquhar，1998)。在作物改良中，育种家需要利用的等位基因来培育优良品种，而上述群体只能对来源两亲本的不同等位基因进行评价。近年来提出的基于连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)原理的关联分析法(association analysis)，把自然群体或自交系品种用于QTL定位研究，也可找到控制重要农艺性状的基因，并发现优异等位变异。连锁不平衡指的是不同遗传标记间存在着的非随机组合现象。座位间的遗传是及时章 数量性状的概念及研究进展

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