第二章 药物常用局部刺激性试验方法与技术

第二节 肌肉刺激性试验

一、肌肉刺激性试验方法

1. 实验动物：体重在2.5~3.5kg 的白色家兔

由于家兔的股四头肌的大小较适合肌肉注射并易于观察，目前，在国际上被广泛应用于肌肉刺激性试验。其次选用250~300g体重的大鼠。

实验动物的性别雌雄不拘，每个实验组的动物数量不少于3只。

2. 受试物：原则上与临床剂量相同，较大给药体积不超过1ml

注射剂量的设置，一般与临床使用剂量相同，也可根据临床用药方案和动物情况等，调整给药容积及速率。建议较大药物容量不超过1ml。

3. 注射要点

(1)注射部位：股四头肌的股直肌。

在大腿前侧，膝关节和股骨关节之间的1/2处垂直进针。

(2)在实验动物一侧股四头肌注射药物，另一侧注射生理盐水作为阴性对照。

设置阴性对照组，通过比较阴性对照组与实验组，有利于确认给药组的病变是否为药

物因素引发。

(3)注射器：1ml的一次性注射器(即4号针头)。

(4)注射要点：①注射前，剃掉注射部位的兔毛，用酒精棉球消毒；②针头垂直刺入

1cm，并固定好；③缓慢注射，1ml/10s；④注射结束后，迅速拔针，不按摩注射部位。

采用无菌操作，注射前用酒精棉球消毒。为了避免注射以外的刺激因素，不对注射部位进行临床上使用的注射部位的按摩。

4. 观察内容

(1)注射时观察：动物是否有躁动等反应，以及注射局部有无改变。

(2)给药后48h观察：注射部位有无改变。

5. 检查方法

(1)麻醉后放血处死。

(2)解剖取出股四头肌：在实验动物的大腿前侧，从膝关节至腹股沟切开皮肤，将股四头肌的筋膜切开后，用钝器分离股四头肌，并取出。

(3)观察股四头肌：在肌肉表面病变最显著处，沿肌束走形纵行切开，观察纵断面的改变，并用福尔马林固定，以供组织病理学检查。

由于股四头肌是一块相对宽而扁平的肌肉块，且肌肉颜色较白，如果存在肌肉刺激性变化，首先能在肌肉靠近皮肤侧观察到，因此，建议首先记录肌肉表面看到的改变及其长径和短径。然后，沿肌肉走行在病变最显著处纵向切开观察纵切面，记录病变颜色及其长径和短径；如果没有显著病变，则在进针部位纵切，观察。

(4)取材：在纵切口左侧沿肌肉走行，取纵断面；右侧垂直于肌肉走行，取横断面。

由于组织病理学结果主要用于确定病变性质和程度，而不是用于确定病变的范围，也为了减少不必要的工作量，提高检验效率，没有必要广泛取材，只需要在肉眼观察病变最显著的部分，平行和垂直于肌肉走行取两块组织即可。

(5)制片：脱水，石蜡包埋，3~5um的切片，伊红苏木素染色，封片。

(6)组织病理学检查方法：主要从四个方面观察，并对各观察项按照半定量的方法在《家兔肌肉刺激试验镜检记录》(见表9-1)中，分别记录各病变的性质及其程度(轻

度，中度，重度)。

建议主要从肌纤维，肌束，肌束间质，以及血管、神经纤维四个方面观察。比如，观察肌纤维有无变性、坏死、溶解，炎细胞浸润，出血等病变，以及各病变的分布范围是局限于少数肌纤维，还是多发，或是弥漫。观察上述病变是局限在一个肌束内，还是发生于多个肌束，并注意观察各肌束的病变程度。观察有无间质水肿、间质增宽，以及有无炎细胞浸润，出血灶等病变。观察有无充血或出血，血管内皮至外膜各层有无病变，有无血栓形成，神经纤维有无损伤等。

6. 判定方法以组织病理学诊断为主要依据

由于实际操作中，进针可能刺穿肌肉中的血管，而引起非药物因素的出血等变化，物理性因素与药物因素引发的肌肉局部刺激性反应单靠肉眼观察无法确认和鉴别，通过组织病理学检查可以区分，因此，将组织病理学诊断作为肌肉刺激性试验结果的主要判定依据，才能根据病变的性质、程度等，、科学地反映引发肌肉病变的原因。

例如，在肌肉刺激性试验的实际工作中，注射生理盐水的阴性对照组，有时也会因为进针而造成血管损伤，形成肌肉内较大的出血灶，肉眼可见颜色变深，较难区别于药物因素引起的肌肉刺激性病变。此问题通过组织病理学像的特点进行区别。

图9-1中，9-1-1生理盐水注射组：可见轻-中度淋巴样细胞浸润，伴有小灶状肌纤维变性坏死。两种病变相比较，淋巴样细胞浸润的病变明显，肌纤维的变性坏死轻微；9-1-2碳酸氢钠注射组：肌纤维灶状变性坏死，组织崩解，伴有轻度淋巴样细胞浸润，肌束间质水肿。相对于明显的组织坏死，淋巴样细胞浸润轻微，为碳酸氢钠注射液的药物毒性作用引起。

因此，建议把组织病理学诊断作为决定性的主要依据，大体观察仅作为试验结果判定的参考项目。最终根据肌肉局部肌纤维变性坏死的病变程度为主，结合药理作用，衡量该刺激性反应与临床治疗目的的矛盾关系，决定该药物是否可以应用于临床，以及指导药物研发改进，减少肌肉刺激性反应。

详实的实验方法，不仅为初次开展本试验的机构和人员提供明确、可操作的实验方法指导，而且，保障不同的实验室、不同的实验人员都能获得较一致的安全评价检验的实验结果，保障客观、科学地评价药物的安全性和有效性。

二、肌肉刺激性试验的不同实验方法比较及建议

为保障注射液、注射用粉针剂等肌肉注射类药物以及一些静脉注射类药物(如核磁共振的造影剂)等临床用药的安全、有效，在新药开发研制和新药申报中，安全性评价是必需的。其中，药物对注射部位肌肉的局部刺激性试验是一项重要的检查项目。

我国已有一些实验方法被广泛使用，但内容多属于指导性原则，较简约，未对实验细节做进一步详细描述，在形成严格、规范的肌肉刺激性试验的安全性评价检验方面需进一步深化。日本在20世纪70年代，以肌肉注射引发的大腿股四头肌挛缩症的医疗事故为契机，厚生省于1979年颁布了关于注射用药的局部障害性试验方法的草案，并于1984年推出了更加完善、合理的注射用药的局部刺激性试验的实验方法的修改案。该方案在日本一直被广泛使用，具有参考和借鉴价值。

1. 实验动物

日本原则上选用体重在2.5~3.5kg的白色家兔，必要时，根据情况也可使用较幼小的家兔、犬、大鼠等。近期也有用小型猪的树脊肌成功进行肌肉刺激性试验的研究。在药物的安全性评价中，好选用对注射剂的反应模式(如对药物的吸收和感受性等)与人体相似的哺乳动物，但是，很多情况下较难达到这一要求。为了能顺利实施试验，原则上选用白色家兔，理由是家兔的股四头肌的大小较适合肌肉注射以及检查，而且也易于进行注射部位的肉眼观察。目前，白色家兔在国际上被广泛使用于肌肉刺激性试验。

我国在该试验中也是家兔，其次可选用大鼠，并规定家兔体重2.5~3.0kg，大鼠体重250~300g为宜。根据实验需要，科学、合理地选用动物，同时也考虑到实验成本，建议以白色家兔和大鼠为宜。

对于实验动物的性别，虽雌雄不拘，但是，日本明确指出在同一实验中，选用单一性别，不要雌雄混合使用；而我国则没有这样的限定，只提出家兔宜单笼饲养，大鼠宜雌雄分笼饲养。对于每个实验条件组的动物数量，日本规定在3只以上，而我国要求不少于2只。考虑到动物的个体差异，尽可能减少对实验结果的影响，有必要多使用不同动物的肌肉进行实验，因此，建议每组3只以上为佳(见表9-2)。

2. 实验设计

受试物原则上使用临床应用制剂，两国在该点上一致。阴性对照组日本规定注射生理盐水；我国要求设生理盐水或溶剂作对照。在日本新药申报的报告中，则可见溶剂需要作为又一个受试物，以生理盐水注射为阴性对照，做独立的肌肉刺激性试验。日本明确规定阳性对照组，使用蒸馏水配制的0.425W/V%以及1.7W/V%的醋酸溶液。理由是已经证明这两个浓度的醋酸不仅可以对肌肉造成明显的2个不同程度的损伤，而且再现性很高，加之该溶液易于配置。我国还没有关于设立阳性对照组的实验要求。由于不同的实验人员对同一现象的程度存在判定差异，同一个实验人员在不同实验中也会出现诊断游移，为获得较客观、的实验结果，有必要设立相对稳定且再现性高的阳性对照组(见表9-2)。

另外，日本的肌肉刺激性试验的实验方法修正案只规定了一次性肌肉注射，而我国则还提出可根据受试物拟用于临床应用的情况决定给药期限，多次给药不超过7天。考虑到临床前试验终归要服务于临床应用的宗旨，以及动物实验要尽量接近在人体使用药物的情况，认为我国的单次和多次给药的肌肉刺激性试验的实验设计优于日本的只有单次给药的实验设计(见表9-3)。

日本规定观察时期为给药后2天以及14天，麻醉下，放血处死动物，进行检查。因为注射2天后的观察有利于了解药物肌肉刺激的变化过程，而注射14天后的观察是有利于了解肌肉刺激反应的持续状况的重要检查，强调这两个时间点的观察都很必要。而我国则只要求末次注射后2天处死动物，进行检查。作为新药开发和申报的重要数据，建议进行这两个或者其他时间点，如给药后2天和7天，甚至更多的时间点进行观察，如给药后2天，7天，14天和21天，以期实现完整、的安全性评价。对于已上市药物的监管等抽样调查时，可根据情况进行调整(见表9-3)。

3. 实验操作

注射剂量的设置，日本的原则为受试物使用成人临床一次用量的1/2，但是上限为1ml的总注射量，并补充说明如果很难实施1/2的成人一次用量时，可根据本实验原则自行设计；生理盐水与受试物溶剂相同；0.425W/V%以及1.7W/V%的醋酸溶液的注射量固定为1ml。

我国对注射剂量的要求较灵活、宽泛，一般可采用与临床制剂相同的浓度，或者高于临床剂量，也可根据临床用药方案和动物情况等，调整给药容积及速率。由于采用与临床相同或更高的浓度，对药物的安全性要求更高，有利于临床安全用药，同时考虑到家兔肌肉所能承受的注射液容量，容量对肌肉组织产生的张力等影响因素，以及便于在相同条件下判定结果，建议在一次较大剂量不超过1ml的前提下，尽可能使用与临床相同浓度或更高浓度(见表9-3)。

日本不仅规定无菌操作注射，注射部位选择家兔股四头肌的中央部，同我国的做法一致，并且详细注明要垂直进针，刺入1cm，并要求缓慢推注，1ml溶液需10秒钟，注射后迅速拔针。为了避免注射以外的刺激因素，不对注射部位进行临床上使用的注射部位的按摩。这些看似繁琐的规定，不仅是保障不同的实验室、不同的实验人员都能获得较一致的安全评价检验的实验结果，而且极其有利于初次开展本试验的机构和人员得到明确、可行的实验方法指导，值得借鉴。

此外，对于注射部位，日本明确提出实验动物一侧股四头肌注射受试物，另一侧可以注射生理盐水作为阴性对照，但是，阳性对照的醋酸溶液则不能，因此，阳性对照组需要另设一个实验组。

4. 病理学检查方法

检查项目包括大体检查和组织病理学检查。日本厚生省颁布的检查方法如下：

对于大体检查，在实验动物的大腿前侧，从膝关节至腹股沟切开皮肤，将股四头肌的筋膜切开后，用钝器分离股四头肌，并取出。对摘取的股四头肌进行如下两项观察：

(1)沿肌肉走行纵向切开，注意要在表面能观察到的变化的最显著部分。观察肌肉纵切面的变化，如是否有出血、白色变化、褐色变化等，并测定该病变的长径和短径，计算出病变面积。

(2)根据需要，将肌肉组织用10%福尔马林固定，以供组织病理学检查。组织病理学检查在注射14天后可见到大体改变时进行，特别是要重视广泛的坏死和纤维化。另外，组织病理学检查的标本不应该局限在小范围，而是应该广泛取材。

我国则要求对观察注射部位肌肉的刺激性反应，并做局部组织的组织病理学检查。

总结实际工作心得并结合多年的病理学研究工作，由于实际操作中，进针可能刺穿肌肉中的血管，而引起非药物因素的出血等变化，因为在记录大体观察结果的同时，应该进行组织病理学检查，并以组织病理学的诊断结果为准，判断药物对肌肉的刺激性。由于组织病理学结果主要用于确定病变性质和程度，而不是用于确定病变的范围，因此，没有必要广泛取材，而只要把病变最显著的部分，平行和垂直于肌肉走行取两块组织即可。

5. 判定方法

日本厚生省1984年颁布的注射剂肌肉刺激性试验方法的修正案和中国均有各自的判定方法，对肌肉刺激性反应进行分级。在多年的新药研制申报的安全性评价检验以及动物实验方法研究中，很多研究人员及学者对判定方法做了有益的探索，对大体病理检查和组织病理学检查提出了各自的观察要点，并不同程度地被应用到实际药品检验及科研工作中(见表9-4)。

在肌肉刺激性试验的实际工作中，作者发现即使只是注射生理盐水的阴性对照组，有时也会因为进针而造成血管损伤，形成肌肉内较大的出血灶，其肉眼所见以为颜色变深，较难区别于药物因素引起的肌肉刺激性病变。此问题通过组织病理学像的特点，可见阴性对照组以出血和大量密集在出血灶的炎细胞浸润，而肌纤维的变性坏死较轻；由药物引发的肌肉刺激性反应则以肌纤维的变性坏死为主，病灶内可见散在的多少不等的炎细胞浸润及红细胞，从而可以区分。因此，建议把大体观察仅作为试验结果判定的参考项目，而把组织病理学诊断作为决定性的依据。

组织病理学检查，建议以肌肉的病理变化为主，按照以下四个层次观察，并对各观察项按照半定量的方法分别记录各病变的性质、程度及范围：

(1)肌纤维：观察有无变性、坏死、溶解、炎细胞浸润、出血等病变，以及各病变的分布范围是局限于少数肌纤维，还是多发，或是弥漫。

(2)肌束：观察上述病变是局限在一个肌束内，还是发生于多个肌束，并注意观察各肌束的病变程度。

(3)肌束间质：观察有无间质水肿、间质增宽，以及有无炎细胞浸润、出血灶等病变。

(4)血管、神经纤维：观察有无充血或出血，血管内皮至外膜各层有无病变，以及有无血栓形成，神经纤维有无损伤等。

通过分析上述组织病理学改变，不仅可以得出药物是否有肌肉刺激性，而且通过分析肌肉组织损伤的病理学特点，有助于进一步探讨该药物的毒理机制。