《病毒学原理》(含卷Ⅰ和卷Ⅱ)深入浅出地将病毒复杂繁多的复制方式及与宿主细胞的关系呈现出来,有利于读者探索治疗和控制病毒感染的方法。卷Ⅰ主要介绍病毒学基础及病毒分子生物学知识,强调了病毒在感染宿主细胞内发生的分子过程;书中设置了丰富的参考文献和附录信息:总结了代表性病毒在细胞中的增殖周期,可方便读者就具体章节和某一专题深入查阅与学习。
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中国科学院"百人计划"入选者
中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室副主任,分子病毒中心主任,中关村科技园区分子病毒及生物制药开放实验室主任。1982年毕业于北京农业大学兽医系,1985年获该校硕士学位,1996年获美国佛罗里达大学分子生物学和细胞生物学博士学位。先后在Oklahoma大学医学中心从事博士后研究,在美国农业部国家动物病研究中心、哈佛休斯医学研究所(HHMI)和GENZMYE生物技术制药公司工作。2004年入选中国科学院"百人计划"。主要从事流感病毒跨种间传播的分子机制、重要病毒的分子进化、致病机理及病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的生物学意义研究;动物重要疫病疫苗、免疫增强剂和抗病毒蛋白质药物的研发。
1基础知识
1.1Luria的信条
1.2我们为什么要研究病毒
1.2.1病毒无处不在
1.2.2病毒引起人类疾病
1.2.3病毒感染一切生物
1.2.4病毒能突破种间屏障
1.2.5我们自身含有病毒
1.2.6病毒是研究生物学的独特而宝贵的工具
1.2.7病毒可用于生物学操作
1.3病毒学的史前时期
1.3.1古代的病毒感染
1.3.2最早的疫苗
1.3.3病原微生物
1.4病毒的发现
1.5病毒的特性
1.5.1病毒结构的简单性
1.5.2病毒的胞内寄生性
1.6病毒的界定
1.7动物病毒的分类
1.7.1经典系统
1.7.2根据基因组类型分类
1.7.3Baltimore分类系统
1.8病毒复制的一般策略
1.9展望
2感染周期
2.1引言
2.2感染周期
2.3细胞
2.4细胞表面的构造
2.4.1胞外基质: 组成成分和生物学重要性
2.4.2细胞膜的特性
2.4.3细胞膜蛋白
2.5进入细胞
2.6病毒RNA复制
2.7合成病毒蛋白质
2.8产生病毒基因组
2.9形成子代病毒粒子
2.10病毒致病机理
2.11克服宿主防御
2.12病毒的培养
2.12.1细胞培养
2.12.2鸡胚
2.12.3实验动物
2.13病毒的分析方法
2.13.1感染性单位的测定
2.13.2噬斑效率
2.13.3病毒颗粒及其成分的测定
2.14病毒的生长:裂解理论
2.15一步生长周期
2.15.1最初的概念
2.15.2一步生长分析: 研究动物病毒的一个有价值的工具
2.16展望
3基因组和遗传学
3.1引言
3.2基因组原理及巴尔的摩分类系统
3.3病毒基因组的结构及其复杂性
3.3.1DNA基因组
3.3.2RNA基因组
3.4病毒基因组是什么样的?
3.5编码策略
3.6病毒序列告诉我们什么?
3.7病毒基因组起源
3.8病毒基因组的"大与小":尺寸真的重要吗?
3.9病毒的遗传分析
3.9.1经典遗传学方法
3.9.2用基因工程将突变引入病毒基因组
3.9.3用双链RNA进行遗传干扰
3.9.4病毒基因组的工程改造:病毒载体
3.10展望
4结构
4.1引言
4.1.1病毒粒子的功能
4.1.2命名
4.1.3研究病毒结构的方法
4.2构建保护性衣壳
4.2.1螺旋形的结构
4.2.2二十面体对称的衣壳或核衣壳
4.3包装核酸基因组
4.3.1基因组和蛋白外壳的直接接触
4.3.2通过特化的病毒粒子蛋白包装
4.3.3通过细胞蛋白包装
4.4囊膜病毒
4.4.1病毒囊膜成分
4.4.2简单的囊膜病毒: 与外部蛋白及衣壳或核衣壳直接接触
4.4.3带有附加蛋白层的囊膜病毒
4.5复杂的病毒
4.5.1T4噬菌体
4.5.2疱疹病毒
4.5.3痘病毒
4.6病毒粒子其他组分
4.6.1病毒粒子酶
4.6.2其他的病毒蛋白质
4.6.3非基因组病毒核酸
4.6.4细胞大分子
4.7展望
5吸附与侵入
5.1引言
5.2病毒吸附细胞
5.2.1一般原理
5.2.2鉴定病毒的细胞受体
5.2.3细胞受体举例
5.2.4病毒粒子如何吸附受体
5.3细胞内吞病毒粒子
5.4膜融合
5.5病毒粒子及亚病毒颗粒在细胞内的运动
5.6病毒通过受体诱导的信号转导
5.7脱衣壳机制
5.7.1病毒在细胞质膜上脱衣壳
5.7.2在内吞过程中脱衣壳
5.7.3在溶酶体内脱衣壳
5.8病毒基因组进入细胞核
5.8.1核定位信号
5.8.2核孔复合物
5.8.3入核途径
5.8.4流感病毒RNP的入核
5.8.5DNA基因组的入核
5.8.6逆转录病毒基因组的入核
5.9展望
6以RNA为模板合成RNA
6.1引言
6.2RNA模板的性质
6.2.1病毒RNA的二级结构
6.2.2裸露RNA及核衣壳RNA
6.3RNA合成装置
6.3.1RNA依赖的RNA聚合酶的识别
6.3.2RNA聚合酶与序列的关系
6.3.3RNA依赖的RNA聚合酶的三级结构
6.4RNA合成机制
6.4.1起始
6.4.2延伸
6.4.3模板特异性
6.4.4RNA模板的解旋
6.4.5细胞蛋白的作用
6.4.6为什么有不等量的正链和负链RNA
6.4.7(+)链RNA上核糖体与病毒聚合酶相遇的问题
6.4.8poly(A)的合成
6.5从mRNA产物到基因组RNA合成的转变
6.5.1mRNA合成和基因组复制由不同的聚合酶完成
6.5.2 核衣壳蛋白抑制基因内的终止-起始反应
6.5.3茎-环结构诱导的抑制终止
6.5.4 mRNA合成和基因组复制用的不同模板
6.5.5抑制多聚腺苷化
6.5.6mRNA合成和基因组复制所用的相同模板
6.6病毒RNA合成的细胞位点
6.7RNA病毒基因组多样性的起源
6.7.1核苷酸的错误插入
6.7.2基因节段重配和RNA重组
6.7.3RNA编辑
6.8展望
7逆转录与整合
7.1逆转录病毒的逆转录
7.1.1发现
7.1.2影响
7.1.3逆转录途径
7.1.4逆转录病毒逆转录酶的基本特征和结构
7.1.5其他逆转录例子
7.2逆转录病毒DNA整合是一个独特的过程
7.2.1在整合过程中整合酶 (IN)催化的步骤
7.2.2整合酶结构和机制
7.3嗜肝DNA病毒逆转录
7.3.1一个具有逆转录酶的DNA病毒?
7.3.2逆转录途径
7.4展望
8转录 策 略:D N A 模 板
8.1引言
8.1.1转录病毒DNA的细胞RNA聚合酶特性
8.1.2一些病毒的基因组必须转变成模板才能转录
8.2RNA聚合酶Ⅱ的转录
8.2.1RNA聚合酶Ⅱ转录的调节
8.2.2调节转录的蛋白共性
8.3只由细胞装置转录的病毒DNA模板
8.4调节RNA聚合酶Ⅱ转录的病毒蛋白
8.4.1调节模式
8.4.2人免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的自我调控转录
8.4.3DNA病毒的转录级联反应
8.4.4进入两种选择性转录程序之一
8.5通过RNA聚合酶Ⅲ转录的病毒基因
8.5.1RNA聚合酶Ⅲ转录腺病毒VA-RNA基因
8.6在病毒感染的细胞内抑制细胞转录装置
8.7细胞转录成分的特殊功能
8.8一种病毒DNA依赖的RNA聚合酶
8.9展望
9基因组复制策略:DNA病毒
9.1引言
9.2通过细胞复制装置合成 D N A :S V 4 0 的 启示
9.2.1真核复制子
9.2.2SV40 DNA合成期间细胞复制蛋白及其功能
9.3病毒DNA合成机制
9.3.1引发和延伸
9.3.2病毒复制起点特征
9.3.3病毒复制起点的识别
9.3.4病毒DNA合成装置
9.3.5病毒复制产物的解离和加工
9.4指数增长病毒DNA复制机制
9.4.1病毒蛋白可以诱导细胞复制蛋白的合成
9.4.2病毒复制装置以及辅助酶的合成
9.4.3不依赖细胞蛋白的病毒DNA复制
9.4.4病毒结构蛋白的延迟合成阻止DNA模板的未成熟组装
9.4.5细胞DNA合成的抑制
9.4.6病毒DNA在特殊的细胞区室中合成
9.5病毒DNA的有限复制
9.5.1整合的细小病毒DNA作为细胞基因组的一部分进行复制
9.5.2通过不同起点调控病毒的复制:Epstein-Barr病毒 (EB病毒)
9.5.3从单一起点开始的可控的指数性复制: 乳头瘤病毒
9.6DNA病毒遗传多样性的起源
9.6.1病毒DNA聚合酶复制保真性
9.6.2双链DNA缺口修复的抑制
9.6.3病毒基因组的重组
9.7展望
10病毒前体mRNA的加工
10.1引言
10.2 病毒Pre-mRNA加工时的共价修饰
10.2.1病毒mRNA 5′端加帽
10.2.2 病毒mRNA 3′-poly(A)节段的合成
10.2.3病毒前体mRNA的剪接
10.2.4 病毒前体mRNA的选择型剪接
10.2.5病毒mRNA的编辑
10.3RNA从细胞核中输出
10.3.1细胞输出装置
10.3.2病毒mRNA的输出
10.4 病毒蛋白对病毒或细胞基因表达的转录后调控
10.4.1病毒基因表达时序控制
10.4.2 病毒蛋白质可抑制细胞mRNA的产生
10.5 调控病毒和细胞mRNA在细胞质中的周转(turnover)
10.5.1 病毒蛋白质调节mRNA的稳定性
10.5.2 在转化时对mRNA稳定性的调控
10.6 抑制基因表达的小RNAs的产生及其功能
10.6.1 小干扰RNAs、 小RNA及其合成
10.6.2病毒miRNAs
10.6.3 阻断RNA干扰的病毒基因产物
10.7展望
11翻译的控制
11.1引言
11.2真核蛋白质合成机制
11.2.1真核mRNA的一般结构
11.2.2翻译装置
11.2.3起始
11.2.4延伸和终止
11.3病毒翻译策略的多样性
11.3.1多聚蛋白的合成
11.3.2遗漏扫描 (leaky scanning)
11.3.3再起始
11.3.4抑制终止
11.3.5核糖体移码 (frameshifting)
11.3.6双顺反子mRNA
11.4病毒感染期间翻译的调控
11.4.1病毒感染后翻译起始的抑制
11.4.2eIF4F的调控
11.4.3poly(A)结合蛋白活性的调控
11.4.4eIF3的调控
11.4.5miRNA的调控
11.5展望
12细胞内运输
12.1引言
12.2细胞核内组装病毒蛋白入核组装
12.3细胞质膜上的组装
12.3.1转运病毒膜蛋白到细胞质膜
12.3.2 在极性 (polarized) 细胞内分类运输病毒蛋白
12.3.3 在病毒感染的细胞中分泌途径被破坏
12.3.4 病毒蛋白以非依赖性信号序列的方式被转运到质膜
12.4与内部细胞膜相互作用
12.4.1 病毒蛋白在分泌途径细胞区室的定位
12.4.2病毒蛋白定位于核膜上
12.5病毒基因组转运到组装位点
12.5.1 从细胞核到细胞质转运基因组和前基因组RNA
12.5.2 基因组从细胞质到质膜的转运
12.6展望
13组装 、释 放 和 成 熟
13.1引言
13.2研究病毒组装和释放的方法
13.2.1病毒粒子的结构研究
13.2.2 通过显微镜观察组装和 释放
13.2.3 组装中间体的生化和 遗传分析
13.2.4基于重组DNA技术的方法
13.3蛋白衣壳的组装
13.3.1结构单位的形成
13.3.2衣壳和核衣壳的组装
13.3.3自我组装和辅助组装反应
13.4 病毒基因组和其他粒子成分的 选择性包装
13.4.1同时组装或顺序组装
13.4.2核酸基因组的识别与包装
13.4.3 病毒粒子酶类和其他非结构蛋白整合到病毒粒子中
13.5囊膜的获得
13.5.1 内部成分的有序组装以及从细胞膜上出芽
13.5.2 内部结构的组装与囊膜的获得协同进行
13.6病毒粒子的释放
13.6.1无囊膜病毒的释放
13.6.2 在细胞质膜的组装: 病毒粒子的出芽
13.6.3 在内膜上的组装: 胞吐的问题
13.7子代病毒粒子的成熟
13.7.1病毒粒子蛋白水解加工
13.7.2其他成熟反应
13.8细胞到细胞的传播
13.9展望
附录结构、基因组结构与感染周期
腺病毒
嗜肝DNA病毒
疱疹病毒
正黏病毒
细小病毒
微RNA病毒
多瘤病毒
痘病毒
呼肠孤病毒
逆转录病毒
弹状病毒
披膜病毒
术语
索引
卷I
9.3病毒DNA合成机制
所有病毒DNA在感染细胞内的复制均含有与SV40 DNA合成相似的过程,即复制起点的识别,前复制复合体的组装,DNA合成的引发、延伸和终止以及复制产物的解离。然而,DNA合成每一步所遇到的机制性问题都是通过一系列病毒特异性机制而解决的。
9.3.1引发和延伸
病毒DNA分子的合成通过一系列不寻常的机制起始,这其中不仅包括RNA、DNA,甚至蛋白质分子也会作为引物发挥功能。由于引发机制会对延伸机制有一定的影响,因此通常将两者结合起来同时研究。
9.3.1.1细胞或病毒的酶类合成病毒RNA引物
引发的常规方式是由特异性引物酶合成一个短RNA分子。众所周知,细胞DNA聚合酶α-引物酶合成多瘤病毒基因组两条模板链复制所需的所有RNA引物。某些疱疹病毒复制起点存在相似机制,如潜伏感染细胞中EB病毒基因组附加体复制的引导机制[见"9.5.2 通过不同起点调控病毒的复制:Epstein-Barr病毒(EB病毒)"]。逆转录病毒的整合性原病毒基因组也是通过RNA引物复制,该RNA引物由细胞复制子(原病毒插入其中)起点处的引物酶合成。因此在分裂活跃的细胞内,每一个细胞周期都伴随着原病毒DNA的复制,但是由病毒蛋白合成RNA引物的情况在DNA病毒中并不常见,不过,这种机制是增殖性感染细胞内疱疹病毒的复制特点。典型例子是HSV-1感染细胞后由病毒引物酶合成RNA引物。这个引物酶是由病毒UL5、UL8和UL25基因产物组成的异源三聚体。
无论是利用细胞DNA聚合酶还是病毒DNA聚合酶,从RNA引物合成DNA都不可避免产生这一结果:两条亲代链之一必须进行不连续复制。当模板是环状时,必须要有一特殊机制完成滞后链的合成。而其他一些DNA病毒基因组则是通过一些选择性引发机制来进行复制,避免了不连续合成方式。
9.3.1.2DNA的引发:病毒基因组中的特殊结构
通过基因组中的特殊结构进行病毒DNA合成的自我引发是所有细小病毒科的重要标志,它们是在动物细胞中复制的最小DNA病毒之一。这一病毒科包括依赖病毒属(如腺联病毒)和自主细小病毒属(如鼠的细小病毒)。所有细小病毒DNA的合成显现出许多不寻常特征,最显著之处即为自我引发,这里以腺联病毒为例描述这一机制。
腺联病毒基因组是一个小分子(
另一方面,通过拷贝能形成引发结构的序列这一特殊机制来完成整个复制过程:初始产物保留有引发所需的发夹结构,是一个亲代链和子代链共价连接的双螺旋DNA[图9.9(b)第2步]。这一步是通过在亲代链内中间体的特异位点形成缺刻(nick)来完成的。这种方式释放的新3′-OH末端引发连续的合成直到DNA分子的末端[图9.9(b),第4步]。缺刻是由病毒蛋白Rep78和Rep68(Rep78/68)所引入的。这些蛋白是位点和链特异性核酸内切酶,结合并切割ITR内的特异性序列。在终末分离的过程中,Rep78/68 共价结合于切割的DNA上(结合位点将成为完整复制分子的5′末端)[图9.9(b)]。合成双螺旋基因组DNA分子(复制中间体)后,3′末端引发发夹结构的形成使得单链基因组能够通过链置换机制进行连续合成,并再次形成复制中间体[图9.9(b),第6和第7步]。
Rep78和Rep68在许多方面都类似于SV40的 LT,可以归为起点识别蛋白(表9.3)。它们是细小病毒DNA合成所需的病毒基因产物。除了识别并切割末端分离位点之外,这些蛋白还具有ATP依赖的3′→5′解链酶活性,是解开复制型ITR和形成具有引发功能的发夹结构所必需的[图9.9(b)第5步]。至于以双链复制中间体作为模板进行复制,是否需要细胞解旋酶的参与,目前仍不清楚。
表 9.3病毒起点识别蛋白
病毒
蛋白
DNA结合特性
其他活性和功能
细小病毒属
腺联病毒
Rep78/68
结合到ITR的特异性序列上;以六聚体的形式结合
位点和链特异性内切酶;ATP酶和ATP依赖的解旋酶;转录调节子
乳多空病毒
猿猴病毒40
LT
协同性地结合到复制起点Ⅱ上,形成双六聚体;扭曲起点;在特殊位点通过磷酸化调节的 DNA结合活性
DNA依赖的ATP酶和3′→5′解旋酶;结合到细胞Rp-A蛋白和Polα-引物酶上;抑制早期转录;激活晚期转录;结合到细胞Rb蛋白以诱导整个细胞周期的进程
牛乳头瘤病毒5型
E1
低亲和力地结合复制起点,在E2蛋白的存在下,能强有力并协同性地结合
与E2的结合对病毒DNA的复制非常重要,DNA依赖的ATP酶和解旋酶
E2
以二聚体的形式结合复制起点的特异序列
通过结合到病毒的增强子上调控转录
腺病毒
人2 型腺病毒
Pre-TP-DNA聚合酶
与复制起点结合,此相互作用被细胞转录激活因子Nf-1和Oct-1刺激
通过DNA聚合酶将dCMP添加到pTP上来引发DNA的合成;病毒基因组两条链的持续合成
疱疹病毒
单纯疱疹病毒1型
UL9
与病毒起始位置特殊位点协同结合;扭曲与之结合的DNA变形
ATP酶和3′→5′解旋酶活性;结合UL29蛋白,病毒引物酶的UL8亚基以及UL42持续合成蛋白
Epstein-Barr病毒
EBNA-1
以二聚体的形式结合在病毒OriP的两簇(FR和DS)上的多个位点
结合到FR序列上,是维持病毒基因组附加体所需,并刺激从特异病毒启动子的转录
……
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病毒学原理(I)--分子生物学病毒学原理(I)--分子生物学
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