实验一DNA的提取

[实验目的]

了解DNA提取的基本原理，掌握DNA的提取方法？

[实验原理]

遗传信息全部储存在DNA -级结构之中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质？脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整？

一？分离纯化DNA的原则

(l)保持DNA分子一级结构的完整性？温度不要过高;控制一定的pH范围(pH5~9)，保持一定的离子强度，减少物理因素对核酸降解的机械剪切力？

(2)防止DNA的生物降解？细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构？因此，所用器械和一些试剂需要高温灭菌，提取缓冲液中也需要加核酸酶抑制剂？

二？分离提取核酸的主要步骤

(一)细胞的破碎

细胞破碎的常用方法有以下几种？

(l)高速组织捣碎机捣碎;

(2)玻璃匀浆器匀浆;

(3)超声波处理法;

(4)液氮研磨法;

(5)化学处理法(SDS？Tween-80等);

(6)生化法(溶菌酶？纤维素酶等)？

(二)核蛋白的解聚？变性蛋白的去除

核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)？氢键和非极性的范德华力？分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解？

提取DNA的一般过程足将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液再经过乙醇沉淀，使DNA从溶液中析出？

蛋白酶K能在SDS和EDTA-2Na存在下保持很高的活性？在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜？核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA-2Na则抑制细胞中DNA酶(DNase)的活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来？

常见的DNA酶抑制剂如下:

(l)金属离子螯合剂？DNA酶需要金属二价离子Mg2+？Cap_的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性？如EDTA-2Na等？

(2)阴离子型表面活性剂？如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中易于沉淀？

常用DNA提取原理如下？

(l)加入10倍体积的缓冲液:10 mmol/L Tris-HCI (pH 7.4)，150 mmol/L NaCI，10 mmol/L EDTA，0.50/ SDS？其中，NaCI破坏核酸一蛋白质间的静电引力，使氢键破坏，核蛋白解聚;EDTA破坏细胞膜？螯合Ca2_，使DNase失活;SDS可破坏细胞膜？抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离m来？

(2)加入蛋白酶K？蛋白酶K是一种非特异性蛋白酶，它可将蚤白质消化成氨基酸？一般工作浓度是50--100 ug/mL？反应时间大于5h，反应温度55℃？

(三)核酸的沉淀

沉淀是浓缩核酸最常用的方法？优点:改变核酸的溶解缓冲液;重新调整核酸的浓度;去除溶液中某些盐离子与杂质？

1.常见的用于DNA沉淀的盐类及浓度(表1-1)

2.有机沉淀剂

(1)乙醇？优点:对盐类沉淀少，沉淀中所含少量乙醇易挥发除去？缺点:需要量大(2~3倍体积)？

(2)异丙醇？优点:需体积小，速度快，适于浓度低？体积大的DNA样品沉淀？一般不需低温长时间放置？缺点:易使盐类？蔗糖与DNA共沉淀;异丙醇难以挥发除去？

(3)聚乙二醇(PEG)？优点:可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DN段？应用PEG600进行DNA沉淀时，使用浓度与DN段的大小成反比？注意:PEG沉淀一般需要加入0.5 mol/L的NaCI或10 mmol/L的MgClp;

(4)精胺(spermine)？精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA？原理:精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的？

3.核酸沉淀的温度和时间

核酸沉淀应该在低温下长时间进行？若溶液中核酸浓度很高，在盐离子存在的情况下，加入异丙醇等后即可看到DNA的絮状沉淀？若溶液中核酸浓度很低，则需在-20℃条件下过夜？酵母tRNA可有助纳克(ng)级的核酸沉淀？大于10 ltg/mL的核酸，冰浴10 min即可有效沉淀？

(四)核酸的保存

1.DNA

DNA样品溶于pH 8.O的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存，或者加1滴氯仿-70℃可保存数年？

2.RNA

(l) RNA样品溶于含0.3 mol/L NaAc (pH 5.2)的2倍体积的乙醇中，-70℃保存？

(2)在RNA溶液中加1滴氯仿或0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻存于-70℃，可保存数年？

(五)常见基因组DNA提取方法

1.基因组DNA提取-CTAB法(植物DNA提取经典方法)

十六烷基三甲基溴化铵( hexadecVlt rimethvlammoniumbro mide，CTAB)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物？该复合物在高盐溶液中(>0.7 mol/LNaCI)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白质？多糖？酚类等杂质盾加入乙醇沉淀即可使核酸分离m来？CTAB提取缓冲液经典配方及改进配方见表1-2和表1 3？

表1-2CTAB提取缓冲液的经典配方

表1-3CTAB提取缓冲液的改进配方

CTAB洼实验流程见图1-1？

2.基因组DNA提取——SDS法

SDS是一种阴离子去垢剂，在高温(55--65℃)条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸;然后，提高盐(KAc或NHd Ac)浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA？

SDS法适用于大部分实验材料的基因组DNA提取，如动物组织？细胞？全血？细菌？SDS法实验流程见图1-2(以动物组织为例)？

图1-2SDS法实验流程

(六)几种常见细胞或组织DNA的提取

1.细菌基因组DNA的制备过程

(l)细胞裂解？0.6倍体积的异丙醇或2倍体积乙醇(可以加入1/10体积的3 mol/L乙酸铵辅助沉淀)？

(2)DNA纯化？CTAB除去多糖，酚氯仿一异戊醇除去蛋白质？

(3)沉淀DNA？10% SDS和蛋白酶K？

2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提过程

(l)组织粉碎？动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末;组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用？

(2)细胞裂解？0.5% SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K，50℃温育？

(3)沉淀DNA？用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇(加入1/10体积的3 mol/L乙酸铵可以辅助沉淀)？

3.从植物组织中制备DNA

(l)组织粉碎？用液氮冷冻后研磨成细粉末？

(2)细胞裂解？用20/ CTAB/13-ME(十六烷基三甲基溴化铵/p巯基乙醇)或l%SDS和蛋白酶K，65℃温育？

(3)沉淀DNA:用0.6倍体积的异丙醇(-20℃)(可以加入1/10体积的3 mol/L乙酸铵辅助沉淀)？

[实验用品]

1.材料

动物组织？

2.器材和仪器

(1)恒温水浴锅？

(2)台式离心机？

(3)紫外分光光度计？

(4)移液器？

(5)玻璃匀浆器？

(6)离心管(灭菌)？

(7)吸头(灭菌)等？

3.试剂

(l)细胞裂解缓冲液？

Tris(pH 8.O)100 mmol/L EDTA (pH 8.O)500 mmol/L

NaCI20 mmol/L

SDS100

胰RNA酶20 ltg/mL

(2)蛋白酶K？称取20mg蛋白酶K溶于1mL灭菌的双蒸水中，-20℃备用？

(3)TE缓冲液(pH 8.O)？高压灭菌，室温保存？

(4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)？

(5)异丙醇？

(6)预冷无水乙醇？

(7)70g乙醇？

(8)灭菌水？

(9)TIANamp Genomic DNA kit (DP304)斌剂盒？

[实验内容]

1.方法一

(l)取新鲜或冰冻动物组织块0.19(0.5 cm:i)，尽量剪碎？置于研钵研碎，加入1 mL的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5mL离心管中，加入蛋白酶K(500 ljg/mL)20 ljL，混匀？在65℃恒温水浴锅中水浴30min(也可转入37℃水浴12~24 h)，间歇振荡离心管数次？在台式离心机上，以12000g离心5min，取上清液人另一离心管中？

(2)加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100 LiL吸头挑出，晾干，用200 ljL TE重新溶解(可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行)？

(3)加等量的酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，12000g离心5 min？

(4)取上层溶液至另一管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000g离心，5min？

(5)取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5 mol/L乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2 min，12000g离心10min？

(6)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉？

(7)用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀物1次，12000 9离心5 min？

(8)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥？

(9)加200 UL TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用？

(10)吸取适量样品于紫外分光光度计上检测浓度和纯度？

2.方法二

使用TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)诚剂盒提取DNA？

(l)动物组织(小于10mg)用液氮研磨后，加入200 FiL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮？

(2)加入20uL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，混匀，56℃放置，直到组织溶解？

(3)加入200uL缓冲液GB，充分颠倒混合，70℃放置10min，直到溶液变清亮？

(4)加入200uL无水乙醇，充分振荡混合15s？

(5)将所有溶液及絮状沉淀加入到吸附柱CB 3中(吸附柱放人收集管中)，12 000g离心30s，弃滤液，将吸附柱放回收集管中？

(6)向吸附柱中加入500uL缓冲液GD，12000g离心30s，弃滤液，将吸附柱放回到收集管中？

(7)向吸附柱中加入700uL漂洗液PW，12000g离心30s，弃滤液，将吸附柱放回到收集管中？

(8)向吸附柱中加入500uL漂洗液PW，12000g离心30s，弃滤液，将吸附柱放回到收集管中？

(9)将吸附柱放回收集管中，12 000g离心2min;

(10)将吸附柱放到一个干净离心管中，加入 TE缓冲液，室温放置3min，离心2min，收集到的溶液即为DNA溶液？

[注意事项]

(l)选择的实验材料要新鲜，处理时间不要过长？

(2)在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成？

(3)提取的DNA不易溶解，可能的原因:DNA不纯，含杂质较多;加溶解液太少使浓度过大;沉淀物太干燥，也会使溶解变得很困难？

(4)电泳检测时DNA成涂布状，可能的原因:操作不慎;污染核酸酶等？

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