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微生物论文:甘草有益微生物论文
【摘要】植物体内大量分布的微生物对植物产生的影响已成为人们关注的热点，特别是那些有益的影响可对植物的生长及活性成分的形成产生一定的作用。甘草作为一种大宗中药，其栽培品的质量一直是人们所关心的问题，甘草有益微生物对提高甘草的品质有重要作用。该文综述了甘草有益微生物的研究进展，以期对提高栽培甘草的质量起到指导意义。
【关键词】甘草;内生菌;根瘤菌;菌根真菌
甘草是豆科甘草属(Glycyrrhiza)植物，其根及根茎为常用中药，市场需求量大。近年来，随着野生甘草资源的急剧减少，且国家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖锐。在这种情况下，对甘草资源的保护性利用及栽培甘草势在必行。近年来，随着人工甘草种植面积的逐年加大，提高甘草的质量成为亟待解决的一个关键问题。相关研究表明，植物有益微生物可以产生促植物生长的活性物质，提高植物固氮性能，促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保障寄主植物健康生长。因此本文就近年来甘草有益微生物的研究进展进行综述，以期对提高栽培甘草的质量有指导意义。
1甘草内生菌的研究现状
内生菌是指一生或至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并且不引起明显组织变化的真菌或细菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］从短叶红豆杉TaxusbrevifoliaNutt的树皮中分离出二百多种微生物，其中有一株内生真菌Taxomycesandreanae能产生紫杉醇，这一研究结果引起学者对内生菌的广泛兴趣。目前，人们已经从长春花、千层塔、银杏、厚朴等多种植物中分离得到了内生菌，并取得了一些成果。
有学者对甘草内生菌也进行了研究，发现内生菌对甘草产生一系列作用。宋素琴等［4］对采自新疆的健康野生胀果甘草不同组织中的内生菌进行分离，并纯化得到149株细菌和2株真菌，鉴定得出149株细菌分属于13个属，2株真菌分属于青霉菌属Penicillium和镰刀菌属Fusarium。有学者发现内生菌可通过拮抗病原菌促进甘草生长。饶小莉等［5］从乌拉尔甘草健康植株的根茎叶中共分离到内生细菌98株，并采用平板对峙方法筛选出6株菌株，其对植物病原菌有明显体外拮抗活性，鉴定这6株拮抗菌株分属萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、Paenibacillusehimensis。龚明福等［6］采用无菌操作技术从野生健康甘草Glycyrrhizauralensis的根、茎、叶、种子、根瘤等组织中分离出内生细菌（Endophyticbacteria)125株，其中31株对棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)具有较强的拮抗活性，这31株内生细菌分属于气芽孢杆菌属(Aerobacillussp.)、气单胞菌属(Aeromonassp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、黄单孢杆菌属(Xanthomonassp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonassp.)、土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)。另有研究发现，从甘草中分离的有些内生菌还可产生活性物质。韦革宏等［7］从乌拉尔甘草和光果甘草中共分离得到68株内生菌，从中筛选出一个来自乌拉尔甘草的菌株Mesorhizobiumsp.CCNWGX022，从该菌株发酵液的石油醚提取物中分离得到了十八烷酸内酯Rhizobialide，是及时次从内生菌中得到此类物质。另有学者研究了内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量变化趋势。林世利等［8］分离出不同月份苦豆子、骆驼刺、苜蓿、铃铛刺、甘草不同部位的内生细菌，研究阿拉尔地区豆科植物内生细菌种群动态。结果显示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的铃铛刺和骆驼刺植株的内生细菌的种类最多。内生细菌种类的分布规律依次为苦豆子中叶＞茎＞根＞种子＞花，苜蓿中根＞叶＞茎＞花＞种子，铃铛刺中茎＞叶＞种子＞花＞根，骆驼刺中根＞茎≥叶＞种子＞花，甘草中茎＞根＞叶＞种子＞花。5种豆科植物生长期中总带菌量平均值在各个月份变化趋势不同，并且各个月份的带菌量处于交替变化之中，说明不同月份5种豆科植物内生细菌的种类和数量不同，同种豆科植物不同组织部位的内生细菌的种类和数量有差异。
2甘草根瘤菌的研究现状
根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生两种类型，为化能异养菌。目前有学者已经从甘草中分离得到根瘤菌并进行了一些相关研究。
目前对甘草根瘤菌的研究多体现在根瘤菌的分类上。杨雪颖等［9］通过对西北干旱半干旱地区68株甘草根瘤菌的表型多样性和抗逆性分离研究，发现1个新类群和1个具有较高抗逆性的菌株。对新类群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035进行16SrDNA全序列测定及系统进化研究。结果表明，CCNWGX022和CCNWGX035与中慢生根瘤菌属内参比菌株的16SrDNA相似性分别大于96.8％和98.3％，判定它们均属于中慢生根瘤菌属。谷峻等［10］采用表型数值分类、16SrDNAPCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对中国北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16SrDNAPCR-RFLP分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。由此得出结论：在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。
3甘草菌根真菌的研究现状
菌根是土壤中某些真菌与植物根的共生体。凡能引起植物形成菌根的真菌称为菌根真菌，大部分属担子菌亚门，小部分属子囊菌亚门。菌根真菌与植物之间建立相互有利、互为条件的生理整体，并各有形态特征，这是真核生物之间实现共生关系的典型代表。根据形态和解剖学的特征，又把菌根分为外生菌根和内生菌根两大类。有学者对甘草菌根真菌进行研究发现菌根真菌可促进甘草的生长。饶小莉等［11］分离了甘草的VA菌根，并用三叶草进行单孢繁殖，将繁殖后的菌根真菌回接甘草，结果发现接种了菌根真菌的甘草植株笔长、根粗、茎叶干重和根干重都有较大程度的提高，均比对照显著增加，并且不同处理对植株生长影响不同，得出结论接种VA菌根真菌显著促进了甘草的营养生长。JingnanLiu等［12］用两种AM菌根真菌Glomusmosseae与Glomusversiforme接种甘草，结果显示接种的甘草相对于对照组在生长的早期和晚期有显著提高，叶摄取磷的量比对照组多，并且根中甘草酸的浓度有所升高，但根部氧化酶活性相对降低了，由此得出结论接种AM菌根真菌有可能成为提高甘草药用价值的有效途径。
4甘草其他微生物学相关研究现状
近年来，对甘草微生物学转化等方面的研究工作也取得了一定成果。谢毛成［13］利用发根农杆菌的Ri质粒，以光果甘草种子胚萌发形成的实生苗不同部位为外植体，成功诱导出光果甘草毛状根，并利用TLDNA中rolC序列中的特异性引物，应用PCR技术对光果甘草毛状根进行了分子水平的鉴定，并利用理化手段对毛状根转化后产生的冠瘦碱进行了薄层定性鉴定，从不同水平上证实了光果甘草毛状根核基因组中已整合了外源Ri质粒的T-DN段。燕飞等［14］利用发根农杆菌R1601对药用植物胀果甘草(GlycyrrhizainflatBat)进行转化，诱导其产生发根。在发根诱导过程中，分别用不同菌液浓度、不同浸染时间对胀果甘草子叶、胚轴进行转化处理，统计、比较各条件下的发根率，结果表明，用稀释2倍的菌液浸染子叶8min时，发根诱导率较高,为56.49%。何晨等［15］用一株产β-葡糖醛酸酶的菌种HC-12对甘草进行液体发酵转化。通过对菌种复合诱变以及应用系统数值化及灵敏值系统调控技术优化了发酵工艺，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。经过柱层析及HPLC及1HNMR鉴定分离得到了甘草次酸纯品，并通过动物实验验证了发酵甘草于未发酵的生品对照甘草具有抗炎活性和镇痛作用显著性效果。
5小结
内生菌对甘草的有益作用体现在：①内生菌有促进甘草生长作用，内生菌可与病原菌竞争营养或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进甘草生长。②有些内生菌可产生活性物质。③内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量呈现一定的变化趋势。另有研究表明，内生菌能产生与宿主相同的活性物质［3］，王兴红［16］推测内生真菌可能与中药的道地性有密切的关系。这些成果对于甘草内生菌的研究有重要意义。
根瘤菌对甘草的有益作用体现在：根瘤菌能够通过与甘草共生，引起甘草根部或茎部结瘤，将空气中的N2转化为可吸收利用的NH4，从而为甘草提供氮素营养，促进其生长。
菌根真菌对甘草的有益作用体现在：甘草和菌根真菌是一种互惠共生的关系，它们之间可以交换各自所需的物质，甘草借助菌根真菌吸收水分、养分和生长促进剂，而菌根真菌也从甘草中摄取自身生长所需要的糖分和其它有机物。菌根真菌是根系的延长和扩展，且比根系吸收水分、养分的能力大得多，可促进甘草的营养生长，提高甘草的药用价值。
微生物转化对甘草的作用体现在：对甘草进行微生物转化，可提高其有效成分含量，用药效果可得到提高。
总之，微生物是个潜力巨大、尚待开发的资源，对甘草相关微生物进行研究有重大意义，有利于提高甘草的质量，对于中药的可持续发展也将起到重大作用。
微生物论文:医学微生物学临床的医学论文
“兴趣是好的老师”。在教学中,教师如何激发学生的学习兴趣,培养其对医学微生物学的兴趣和热爱,是学好医学微生物学的动力源泉。在对教学工作的不断探索和改革中我们发现,首次的绪论课会给学生带来先入为主的影响,关系到学生对教师及课程的评价,直接影响学生对课程的学习积极性和主观能动性。通过绪论课可以启发学生的学习动机,激发他们的学习兴趣。同时,在绪论课上可以设置一些问题(如人体自身肠道中的微生物与机体组织之间存在怎样的相互作用?微生物的耐药性是怎么产生的,我们应该怎样解决耐药现象日益严重这一问题?曾经一度被控制的传染病又开始死灰复燃,原因是什么,我们应该如何应对?),在后续的授课过程中逐渐揭开谜底。这样带着问题开展学习,可以较好地启发学生的学习积极性,让学生主动开启微生物知识的大门。近年来由病原微生物引起的传染病严重威胁着人类的健康,大量的新闻报道使学生对这些病原微生物有了一些粗浅的认识,将这些内容加入课堂教学内容中不仅可以增强学生学习的兴趣,使内容变得更加生动,而且使学生充分认识到微生物原来距离我们如此之近,使理论知识找到实际落脚点。比如2010年8月,美国鸡蛋因受沙门氏菌污染从而导致至少1300人受到沙门氏菌的感染。2011年,德国下萨克森州的豆芽被肠出血性大肠杆菌EHEC污染,从而造成22人因生食豆芽死亡,2200人住院治疗。此外,还有近来流行的H7N9病毒、埃博拉病毒等。我们通过这些公共卫生事件的引入,讲解相关病原微生物的生物学性状、致病性及免疫性、微生物学检查法及防治原则,使学生有强烈的探索欲望,有效提高了课堂学习效率。
2灵活多样,结合临床,增强学生的主观能动性
教学方法的选择应根据不同的认知对象、不同的学科、同一学科的不同内容从而选择不同的方法,但不管采取何种教学方法,关键在于把课上活,充分调动学生参与教学的积极性。因而根据教学内容的不同,我们采取了多种教学方法。如对于细菌的形态和结构这一章节内容,采用直观的多媒体教学可以让学生形象地看到各种细菌的形态、基本结构及特殊结构;在细菌各论部分,选取部分教学单元由学生自主教学。教师事先根据教学目的、教学内容提出授课提纲、学习重点及难点并确定人员分组。小组成员细致分工、相互协作,在课后完成资料素材收集及教学课件的准备。在此期间,教师与学生进行充分沟通,及时为学生排疑解惑,引导学生在教学大纲的框架下安排课堂讲授内容,并传授讲课技巧及注意事项。同时设计《学生自主学习实践评价标准》,由学生从教学内容安排、课件制作、语言表达等多方面互相进行评议、分析和总结,教师进行点评总结。这种教学方式一方面活跃了课堂气氛,加深学生对所学知识的理解,增强了学生的团队意识,另一方面也可以让教师在与学生的互动中、从学生独特的视角中发现许多平时不会思索的问题;在学习引起人类疾病的常见病毒这一部分内容时,采取专题讨论方式进行学习。专题讨论式学习由教师提出专题,分组学生在本专题内提出应深入讨论的问题,查资料,作综述,课堂进行讨论。例如“人类免疫缺陷病毒”的讨论式教学,学生提出一系列问题,如HIV-1感染的分子机制及免疫反应、T细胞功能受损的疾病、HIV疫苗的研究等,经过讨论,不仅完成了教学内容,而且为学生提供了一次“综述训练”的机会,教学效果令人满意。此外,作为一门与临床学科关系十分紧密的基础课程,我们在教学过程中十分注重微生物学知识的临床应用,采用PBL教学法将临床病例分析引入课堂讨论教学,由病引入菌,菌中解析病,菌病结合,解除病菌。如此,在整个讲授过程中就将病原微生物的生物学特性、致病物质与致病机制、检查及防治原则讲解清楚。
3反映前沿,开阔视野,培养学生创新能力
在教学过程中,既要将教材中最基本、最核心的理论知识传授给学生,为学生自主学习打下坚实的基础,同时要补充一些开拓性、时代性和应用性较强的学科前沿内容。如微生物的耐药性这一章节,我们为学生播放与耐药机制相关的视频和短片,引导学生就微生物耐药机制的产生及防控进行积极的讨论,鼓励学生查阅耐药机制近期的高质量学术论文并就学习心得进行讨论交流,取得了良好的效果。此外,在授课过程中结合教研室老师的科研方向,为学生讲授该领域的研究进展,如人体微生态学与免疫性疾病的相关性研究进展、新出现的传染病病原体、流行性感冒病毒的研究进展等教材中鲜有介绍的前沿动态,从而启迪学生思维,拓宽学生的知识面。同时鼓励学生积极参与教师的科研课题,通过进行科学实验研究进一步激发学生学习微生物学的兴趣及爱好,培养学生发现问题、解决问题的能力和创新能力,提高学生综合素质。
4利用网络,练习巩固,搭建师生交流的良好平台
我校于2006年底引入Blackboard教学教育平台,以整合学校所在的杭州滨江高教园区知识管理系统为载体,在园区师生中普及终身学习的观念;培养学生自主学习、探究性学习和协作学习的方法;改变教师的教学观念和教学方法,强化师生交流互动,调动学生参与、协商教学改革,不断改善师生的教学关系;引导、鼓励品质教学资源的共建共享,提高师生教学资源与占有水平,实现教育资源的拓展。本教研室针对五年制学生基础较好、学习能动性较高的特点,让学生利用Bb平台以及互联网其他资源,结合案例式教学,对医学微生物学课程教学模式进行改革。以问题为基础,让学生处于一个将来知识被应用时相似的环境中,促进学生从不同角度思考问题的能力、加强自我指导性学习、问题解决技巧等能力,充分激发了学生的学习兴趣及积极性。同时,教研室利用Excel表格建立课程选择题题库,用Excel函 数与宏语言构建选择题练习程序。机组选项题的选项由程序根据知识库计算组合而成,实现考查内容的“72变化”,有利于考查学生对特定具体学科问题的掌握能力,并防止了考试对知识的简单再现,以及学生对知识的死记硬背。这种题型设计灵活,考核的内容源于大纲、教材,但又不拘泥于大纲和教材,摆脱了教材文字的束缚,更有利于考查学生的学科综合能力。在此基础上我们将选择题练习程序改进成可利用计算机局域网进行课程选择题的练习系统,并在教学实践中得以应用。选择题库设计成游戏模式,根据获得的分数和难度进级,极大地刺激了学生的学习兴趣,寓教于乐。我们将攻关练习题库分割成五级:1级0-20分;2级21-40分;3级41-70分;4级71-90分;5级91-100分,可将此部分内容作为平时成绩的一部分,计入的考核成绩。我们在医学微生物学教学过程中,一直遵循“学生是教学主体”,并始终贯穿“互动”的教学理论。为了培养高素质人才,在教学中我们还需要继续探索合适的教学方法及教学模式,学习国内外先进的教学理念及教学方法,注重知识更新,紧跟学科发展的步伐,通过不断的学习进一步提高教师自身的综合素质,这样才能更好地指导学生探索微生物世界的奥秘。
微生物论文:中医学专业微生物及免疫学教学体会
微生物及免疫学属于医学基础课,具有名词多、描述多、概念抽象、难记忆、难理解等教学特点,理论相对枯燥,实践性不强,是医学院校学生普遍感到难学的课程[1],对于文科生占大多数的中医专业学生来说就更是难上加难,在学习过程中,学生对过难、过深的东西都不会感兴趣。因此结合中医专业学生的特点,进行教学方法的改进,来提高他们学习这门课程兴趣和主动性。
中医专业的学生特点是学生家庭以从事医务和知识分子为主,尤以中医名家子弟较为突出;而生源结构中以城市、文科及女生人数相对偏多[2]。据统计我校中医专业文科生能占75%,而女生人数可以达到70%。针对中医专业学生的特点,在微生物及免疫学教学过程中进行教学方法的改革来提高教学效果。
1.找到两者共同点—类比(利用优势攻克难点)
医学院校招文科生多,主要是因为中医学在其长期的发展中受到了古代哲学的深刻影响。中医药及相关专业学科具有特殊的人文哲学属性[3]。其吸收了古代盛行的哲学思想如精气、阴阳、五行等,并以这些理论为基础,构建自己独特的理论体系,是古代多学科交互渗透的产物[4]。所以可以看出中医学理论是在中国的历史文化背景下的蕴育而出的。而文科生文史知识丰富、善于阅读、思维活跃,考虑这方面因素,文科生能够比较好的理解中医理论。这是文科生的优势。并且中医的基础理论在大一就已经学过了,包括医古文、中药、方剂等课程已经学过,中医对他们的熏陶已经使学生对其很认可了,所以利用他们已知的和熟悉的知识理论来类比性的介绍新的知识,理解起来较为容易一些。
例如中医理论是建立在阴阳五行这种朴素的哲学理念上的,中医讲究的是阴阳平衡(包括人体内部和环境),而微生物及免疫学实际上也讲究平衡,讲究病原微生物与人体免疫系统的平衡,以及病原微生物之间及外界环境之间的平衡。这一点使他们的最基本的共同点。所以在讲课时把微免的这些平衡与中医的阴阳平衡进行类比的方式进行讲授,受到学生的认可。在讲消毒和灭菌的这一章时可以强调对于病原微生物与我们人类并不是你死我活的状态,而是我们也要与它们保持平衡,因此在不同的时期,根据不同的目的,我们是要采取不同的消毒灭菌的方式是来保持这种平衡,而并不是一味的杀死病原微生物。紧接着举一些例子来证明。例如我们生病了,进行输液时,这个注射用的生理盐水一定是无菌的,因为生理盐水是要进入我们的血循环中的,血循环是没有任何细菌的,为了不破坏这样的平衡,我们注入血循环中的任何药物都必须是无菌的。但是对于人体的有些部位,例如女性的阴道,本身就有大量的细菌,是以乳酸杆菌为主,有些女性经常冲洗阴道,破坏了阴道本身的平衡,反而容易得阴道炎。就这些生活中生动的例子可以让学生感受到人体的这种微生态的平衡与中医上讲阴阳平衡很相似,无论哪种平衡被破坏都会引起疾病,这样理解起来也就不困难了。在微生物及免疫学的整个授课过程中不时的去穿插一些学生熟知的中医理论知识,可以进行类比。微免课程探讨的就是病原微生物与人体免疫系统的相互作用,其相互作用的最终是——平衡或不平衡。这要求教师大概了解中医理论的知识。
2.在绪论中介绍背景知识
中医专业学生因为没有相关学科的背景知识,有相当一部分学生反映上课听不懂。即认知结构中没有适当的起巩固作用的知识观念可利用,阻碍了新的学习与保持,因此提供背景信息及相关的概念将有助于启动他们的学习[5]。例如在课堂上加入一些本学科的背景知识教学效果较好。对于大多数是文科生的中医专业学生来说,他们的想像力是十分丰富的,需要教师去组织语言,可以通过这几点来将微免的发展简史讲的生动而具体:人类在没有发现微生物时对疾病的看法,以及人类是怎样发现微生物的,以及是怎样把它和疾病联系到一起的,是怎样来寻找预防和治疗的方法。做好这一点,对于提高学生学习本门课程有很大的帮助。
3.增加内容的趣味性
在授课过程中,可以用一些小故事、图片、视屏、生活(增加与原有知识相关性)等各种方式来提高课程内容的趣味性。伟大的科学家爱因斯坦说过:“兴趣是好的老师”。 兴趣是学生学习的动力和加速剂,是一切创新动力的重要源泉,是学生掌握知识,发展智力,形成创新能力的内在动力[6]。例如介绍培养基时,可以将科赫发明培养基的过程较详细的讲给学生,不单单增强内容的趣味性,而且在这些发明的过程中渗透了很多科学家的的科学素质和道德品质,无形中对学生的科学素质和道德品质有了一定的影响。课堂上还可以应用多媒体播放一些相关视屏,例如在讲到流感病毒时,播放了一个《流行感冒的发病过程》的视屏,受到学生的欢迎,因为在视屏中病毒不再是看不见摸不到的,甚至在免疫学中的免疫细胞也是栩栩如生的,是学生有耳目一新的感觉,甚至突然对微免学茅塞顿开感悟。在上的每一次课中去花一些心思来设计好每一次课的引课,也是可以较好的提高学生的学习兴趣。中医专业学生条理性的思维可能比理科学生占多数的一些专业的学生稍逊色,但发散性的思维较好,介绍课程中的与人文科学相关的内容,用一些有趣的、能打动学生的历史过程,唤起学生的求知欲效果较好。
4.介绍书籍网站
阅读是人类社会中不可缺少的一种认知活动, 是人类汲取知识的重要手段和认识周围世界的途径之一, 是学习所有学科的基础[7]。文科生较多的中医专业学生的阅读能力较强,可以通过介绍与之相关的有趣的的内容来开阔学生的视野。可以向学生介绍相关课外书籍和网站。这样做可以使学生的视野开阔,相当于本课程是一个原点,以这个原点向外发散出去,了解了相关内容,再回到原点,则感觉课本中的内容并不是难以理解和枯燥,这样学生就会觉得学这门课程很轻松。
综上说述,结合中医专业学生特点,利用其特点进行一些教学方法的改进,的确可以让学生不再觉得微生物及免疫学是比较枯燥、抽象和难学的一门课程。实际上中医学与微生物及免疫学都与哲学有很多联系。爱因斯坦这样谈论哲学:如果把哲学理解为在最普遍和最广泛的形式中对知识的追求,那么,哲学显然就可以被认为是全部科学之母学。在课堂内容中加进些人文性的(包括哲学,科学,思想、人文素质等)知识,有助于提高学生各方面能力。
微生物论文:微生物常规鉴定的技术
一、形态结构和培养特性观察
1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况
2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有:
1、糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。
试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置36±1.0°C培养,每天观察结果,检视培养基颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体培养基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力,从而进行各种细菌的鉴别,因而每次试验,常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫,溴百里蓝和An-drade指示剂。
2、淀粉水解试验
某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。
试验方法:以18~24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板(一个平板可分区接种,试验数种培养物)或直接移种于淀粉肉汤中,于36±1°C培养24~48h,或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行的过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间,培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性,以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱,因而以临用时制备为妥。
3、V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。
试验方法:
1)O’Meara氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养48h,培养液1ml加O’Meara试剂(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液)1ml,摇动试管1~2min,静置于室温或36±1°C恒温箱,若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。
2)Barritt氏法:将试验菌接种于通用培养基,于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml,摇动2~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36±1°C恒温箱,如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
3)快速法:将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后放置5min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时,通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。
4、甲基红(Methyl Red)试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红。
试验方法:挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于36±1°C或30°C(以30°C较好)3~5天,从第二天起,每日取培养液1ml,加甲基红指示剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色 ,阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂,pH范围为4.4~6.0,其pK值为5.0。故在pH5.0以下,随酸度而增强黄色,在pH5.0以上,则随碱度而增强黄色,在pH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。
5、靛基质(Imdole)试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。
试验方法:将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36±1C培养24h时后,取约2ml培养液,加入Kovacs氏试剂2~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性,或先加少量禁药或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或禁药等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为。
6、硝酸盐(Nitrate)还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法:临试前将试剂的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面,立即或于10min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。
用α-萘胺进行试验时,阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
7、明胶(Gelatin)液化试验
有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。
试验方法:挑取18~24h待试菌培养物,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天
观察结果,若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化,如确被液化,即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂,若为阳性,10~20min后,菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。 8、尿素酶(Urease)试验
有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
试验方法:挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇均,于36±1℃培养10,60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果,如阴性应继续培养至4天,作最终判定,变为粉红色为阳性。
9、氧化酶(Oxidase)试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化,产生颜色反应。
试验方法:在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。
10、硫化氢(H2S)试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物,而产生硫化氢气体,硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
试验方法:在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中,沿管壁穿刺接种,于36±1℃培养24~28h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法:将待试菌接种于一般营养肉汤,再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空,以不会被溅湿为适度;用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。
11、三糖铁(TSI)琼脂试验
试验方法:以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物,穿刺接种并涂布于斜面,置36±1℃培养18~24h,观察结果。
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄);产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸,因接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。
12、硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验
试验方法:以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度,置36±1℃培养18~24h,观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性,混浊或沿穿刺线向外生长为有动力,然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面,静置10min,若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部,可作为对照。
本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选,与三糖铁琼脂等联合使用可显着提高筛选功效。
三、血清学试验
血清学反应是指:相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用,可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中,常用血清学反应来鉴定分离到的细菌,以最终确认检测结果。
血清学反应的一般特点:
1)抗原体的结合具有特异性,当有共同抗原体存在时,会出现交叉反应。
2)抗原体的结合是分子表面的结合,这种结合虽相当稳定,但是可逆的。
3) 抗原体的结合是按一定比例进行的,只有比例适当时,才能出现可见反应。
4)血清学反应大体分为两个阶段进行,但其间无严格界限。及时阶段为抗原体特异性结合阶段,反应速度很快,只需几秒至几分钟反应即可完毕,但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段,表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢,需几分、几十分以至更长时间。而且,在第二阶段反应中,电解质、PH、温度等环境因素的变化,都直接影响血清学反应的结果。
习惯上将经典的血清学反应分三种类别:凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。
1、凝集反应
颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合,在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应(Agglutination reaction)。其中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。在该反应中,因为单位体积抗体量大,做定量实验时,应稀释抗体。
1)直接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应,称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。
a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴,在玻片上混匀,数分种后若出现肉眼可见的凝集块,即阳性反应,证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便,但不能进行定量测定。
b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量,故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小时观察,血清较高稀释度仍有明显凝集现象的,为该抗血清的凝集效价。
2)间接凝集反应
将可溶性抗原(抗体)先吸附在一种与免疫无关的,颗粒状微球表面,然后与相应抗体(抗原)作用,在有电解质存在的条件下,即可发生凝集,称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应,敏感性很高。
2、沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合,在有适量电解质存在下,经过一定时间,形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应(Precipitation)。反应中的抗原称为沉淀原,抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大,为了不使抗原过剩,故应稀释抗原,并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
1)环状沉淀反应:是一种定性试验方法,可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原与抗体对应,则在两液界面出现白色的沉淀圆环。
2)絮状沉淀反应:将已知抗原与抗体在试管(如凹玻片)内混匀,如抗原抗体对应,而又二者比例适当时,会出现肉眼可见的絮状沉淀,此为阳性反应。
3)琼脂扩散试验:利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散,若抗原抗体对应,且二者比例合适,在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体,就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行,常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。>
3、补体结合反应
补体结合反应(Complement fixation reaction)是在补体参与下,以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性,能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合,就会出现溶血现象,如果与细菌及相应抗体复合物结合,就会出现溶菌现象。因此,整个试验需要有补体、待检系统(已知抗体或抗原、未知抗原或抗体)及指示系统(绵羊细胞和溶血素)五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌,是补体与待检系统结合的结果,说明抗原抗体是相对应的,如果出现溶血,说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂,敏感性高,特异性强,能测出少量抗原和抗体,所以应用范围较广。
微生物论文:根际微生物群落与促生菌多样性及其筛选的理论综述
1904年,德国农学家Hiltner发现豆科植物根附近区域的土壤微生物,由于受到根系分泌有机物质对其产生的“效应”,表现出相对更高活性的现象,并首次提出“根际”(Rhizosphere)这一概念[1]。现在我们知道,这种“效应”其实是根际微生态系统中的根际效应。单棵植物根际范围虽小,但放眼看,根际却是地球上较大的生态系统,其能量流也极其巨大,因而,根际在生物圈功能中的作用非常显着。曾有研究人员估算,植物20%~50%的光合产物是通过根部释放出来的[2,3]。
根际土壤中存在大量的宏观生物和微生物,如细菌、真菌、原生动物和藻类生物等,细菌是该群体中数量最多的一类微生物。微生物和植物在根际环境中形成的复杂网络式关系会直接和间接地影响植物生长;反过来,植物通过分泌有机物,构建起一个有选择性的环境条件,以利于对其生长有益的细菌,导致根际细菌多样性偏低[4,5]。植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)在根际微生物群体中研究最为热门,也是对农业生产具有应用价值的一类微生物。由于PGPR数量众多,且在根际定殖时具有竞争力,加之其作用机制的多样性,因此能在很大程度上影响植物生长。然而,人们在使用PGPR或相关制剂时,普遍发现大田应用效果远不及盆栽或温室条件下的效果理想,主要原因是PGPR对“陌生”环境的不适应。根际微生物是野外环境中的主要“陌生”因素,因此,了解与某些基本生态过程,如复杂性、自然选择、种间关系(共生、寄生、共栖和竞争)、演替或扰动效应有密切关系的根际微生物群落结构和多样性,可以帮助人们更好地理解根际生态系统,并为PGPR的筛选和高效利用提供理论依据。基于此,本文主要从根际微生物群落多样性、PGPR生态和遗传多样性以及PGPR的筛选策略等3个方面进行综述。
1 根际微生物群落多样性
微生物多样性包括物种、遗传与变异以及功能多样性[6]。在根际系统中,细菌群落的功能多样性是基于其遗传变异以及和其他原核、真核生物(如植物)的互作关系。直至现在,根际微生物多样性与根际微生物功能之间的关系仍不十分清楚。根际微生物多样性信息的缺乏,其原因一是其种类繁多,二是绝大多数微生物的不可培养性。
1.1 根际微生物群落结构的研究方法
研究微生物群落结构,就必须了解各类群微生物群体的种类及数量。传统技术是通过从根际土壤中提取、分离微生物,实验室条件下对其进行形态学、生化和遗传学检验。由于细菌往往和土壤基质以及其他细胞紧密附着,因此在细菌提取中常用到分散剂,即用物理或化学方法将细胞和基质区分开,之后才能对分离细菌生物量进行测定。
微生物生物量的测定常用方法有:显微镜下直接计数(如吖啶橙染料染色)[7]、微生物呼吸量测定(如基质诱导呼吸量,Substrate induced respiration,SIR)[8]、ATP含量测定[9]、较大或然法(Most probable number,MPN)计数[10],使用脂类生物标志物[11]以及氯仿土壤熏蒸法[12]等。但是,土壤中可培养微生物比例毕竟极低。有研究者曾估算这一比例只有不足1.0%(0.2%~0.8%)[13]。正因为如此,基于平板培养法研究土壤微生物多样性存在重大缺陷,免培养技术顺应而生。所涉及的技术包括磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid analysis,PLFA)分析法[14-16]、DNA/RNA杂交[17]、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、核糖体RNA测序[18]、(G+C)含量[19]、温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)和变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)[20,21]、DNA微阵列(DNA microarray)[22]技术(又称“DNA阵列”或“DNA芯片”)、克隆文库分析等方法。过去20多年间,人们利用这些技术手段揭示了很多有关土壤微生物群落的信息[23]。这些方法各有优缺点,正确选择合适的方法进行研究,有助于更地了解根际土壤微生物群落结构特征。
1.2 根际微生物活性和功能多样性的研究方法及根际PGPR活性
研究根际微生物活性的经典方法,是将细菌进行培养、分离并作理化试验。另一个方法是利用细菌在不同培养基上的生长速率来表征该菌在环境中的生理特性、养分利用特点和自适应策略[24]。
目前,人们广泛采用某一关键酶活性的测定来表征某类群微生物的多样性和代谢活性。此外,Biolog体系也是应用较为广泛的方法之一[16,25]。另外,通过克隆构建大片段DNA文库(如BAC library),有助于更地揭示土壤中可培养和不可培养微生物,以及土壤微生物生态系统的相关信息[22]。未来土壤微生物群落结构的研究无疑会大量运用DNA微阵列技术[22],因为该技术可以利用其高特异性特点,将不同活性微生物区分开,并有助于解释同一菌株在不同环境土壤样本中的生态位的异同。当然,基因转录、蛋白质组学等技术也是未来微生物学研究中不可或缺的辅助手段[22,26]。
根际微生物多样性反映了微生物群落的代谢活跃程度。在土壤中接种PGPR,只要能存活,无论是否改变微生物群落结构,都会在一定程度上影响群落的代谢活性[15]。因此,接种PGPR是否能在土壤中存活并竞争是一个十分关键的问题,受物理的(质地、温度和湿度等)、化学的(pH、养分的可利用性、有机质含量等)以及和根际其他微生物之间的互作关系等因素的影响。其中,PGPR与根际土着微生物的互作关系是一个十分重要的影响因子,因为接种PGPR需要在根际形成新的生态位,并在根际定殖,且能竞争足够的养分。总之,接种PGPR后,要能以有限的群体发挥应有的生物效应。
目前,人们可借助多种技术研究根际土壤微生物活性,比如前面介绍过的同位素(3H、14C)标记DNA的胸腺嘧啶核苷或蛋白质的亮氨酸组分,来估算群落代谢活性和生长状况[7,27]。此外,还可以用SIR技术定量测定根际微生物活性[8]。
2 PGPR生态及遗传多样性
近些年来,由于人们愈加深刻地认识到根际生态系统的重要性,加之PGPR作用机制研究的不断深入[28],越来越多的PGPR被筛选出来并加以鉴定。从结果看,很多属都有PGPR的分布。下面以目前PGPR相对集中的几个属来阐述其生态特征和多样性。
2.1 固氮PGPR(Diazotrophic PGPR)
自生固氮菌大概是首个被发现具有促生作用的根际微生物。自20世纪70年代,固氮螺菌属(Azospirillum sp.)的菌株就已被分离出并应用于实践[29]。其他还有能起促生作用且能自生固氮的属种主要有固氮弓菌属(Azoarcus,Az onexus,Azospira)[30]、布克氏菌属(Burkholderia sp.)、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、草螺菌属(Herbaspirillum sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)和多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)等[31]。上述这些细菌可以从许多种类植物,包括水稻、甘蔗、玉米、高粱以及其他谷物,甚至菠萝、咖啡豆的根际分离到。
最近,固氮弓菌因其遗传和代谢多样性而逐步引起研究者的关注。该属细菌能生长在以羧酸类或乙醇为碳源的培养基上,而且最适生长温度在37~42 ℃。
2.2 杆菌(Bacillus)
土壤中的G+杆菌有95%属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),其余5%属于节杆菌(Arthrobacter)和弗兰克氏菌(Frankia)[32]。许多杆菌能在逆境下形成芽孢以增强生存能力,一些杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)还具有固氮能力[33]。杆菌类的PGPR具备多种促生能力[14,34,35]。
2.3 假单胞菌(Pseudomonas)
在植物根际土壤G-细菌中,假单胞菌是数量最多的一类,该属中的PGPR也因为促生能力广泛而被人们所熟知[14,36,37]。假单胞菌属细菌生态多样性丰富,国内外已经从许多植物根际土壤中分离出大量该属的细菌。假单胞菌细菌往往代谢功能多样,可以产生抗生素、嗜铁素或氰类化合物等多种代谢物[38]。这些代谢物通过抑制其他有害微生物以及帮助植物吸收土壤养分,从而影响根际生态环境。
2.4 根瘤菌(Rhizobia)
这里提及的根瘤菌是指能在非豆科植物根际进行非特异性定殖,并释放促生调控因子,如嗜铁素、氰类化合物或进行溶磷等作用,提高土壤养分的可利用性[39]。已有报道指出,在作物和一些非豆科植物轮作后,其根际微生物数量会大幅增加[40],这对随后的作物生长十分有益[41]。
3 PGPR筛选策略
由于野外植物根际土壤是PGPR高密度集中地,因此该区域成为筛选PGPR的来源地。进行筛选工作时,不同土壤类型、植物种类、季节以及植物生长期都必须考虑,以保障筛选到最多的菌株。且一般土壤根际有2%~5%的细菌属于PGPR。由此可见,野外植物根际是筛选PGPR的来源地[4,42]。细菌成为PGPR的先决条件是,当被接种后,能在根际土壤微生物群体中表现出相当的竞争力。
筛选PGPR的及时步工作,是获得足够多的根际土壤细菌。通常认为根际土壤是指紧密附着在植物根表(1~3 mm区域)的土壤。试验中,通常将植物根表土壤剧烈抖
精品源自地理科精品源自地理科
掉后,仍紧密附着的土壤作为根际土壤,用于筛选工作。当然,根据研究需要,除了根际土壤细菌,也可筛选根际内生细菌,因为这部分细菌也有不少是PGPR。也有一些研究者将植物根用自来水轻柔冲洗,仍附着的土壤被看作根际土壤而进行PGPR筛选。
根际土壤充分悬浮于无菌水、磷酸缓冲液或生理盐水。一些化合物如焦磷酸盐可作为土壤分散剂,但也可以影响细胞膜的通透性[43]。一些化学分散剂,如螯合剂可以用单价的阳离子(Na+)交换土壤颗粒的多价阳离子(Ca2+),从而减弱土壤颗粒对细菌细胞的离子吸附作用。不少研究者用亚氨基二乙酸制成的离子交换树脂,如Dowex A1[44]或Chelex-100[45,46]。其他的一些分散剂有Tris缓冲液或六偏磷酸钠[47]。由于微生物细胞被其胞外聚合物紧密附着于土壤颗粒,有时也会使用去污剂。Macdonald[44]曾用0.1%的脱氧胆酸钠作为去污剂,同时用Dowex A1作分散剂处理,土壤微生物的浸出率可提高84%。后来,Herron等[45]将此方法作了改进,用Chelex-100替代Dowex A1,同时用聚乙二醇6 000(PEG 6 000)溶解并分散土壤微生物。还有人在用吖啶橙染色计数土壤细菌数量时,用0.2%的六偏磷酸钠作为溶剂[10]。此外,柠檬酸盐缓冲剂作土壤溶剂研究微生物细胞膜磷脂特性[48],Winogradsky溶液用于分子生物学手段(ARDRA、DGGE或REP-PCR等)研究微生物多样性。
化学浸出法一般要结合物理法,可分为3类:摇荡法、混合法(均质或研磨)和超声波法。摇荡法是这3种方法中效率低但却适用于一些敏感型的细菌或噬菌体。均质化处理会破坏一些细胞结构,特别是G-细菌,导致浸出液具有选择性。轻微均质化处理结合化学分散剂的使用往往具有更高的效率[49]。超声波处理是这3种方法中效率较高的方法,但对一些黏性土壤,需要对样品进行预处理[50]。然而,很多如G-的敏感型细菌会在处理过程中遭到不同程度的破坏,当然,选择较小频率的超声波处理可以避免这一情况的发生。
当获得足够多的根际细菌后,有如下两个策略可以筛选到所需的PGPR:①根据前文介绍的PGPR一般比较集中的几个属,通过选择性培养基和培养方法筛选目标PGPR。例如,Founoune等[51]用选择性培养基将荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)从刺槐根际筛选出来;②将所得到的根际细菌进行体外促生能力测定,保留具有促生潜力的菌株。然后对所得菌株进行遗传学试验,剔除同一属里相似的一些菌株,尽可能获得多个属里不同功能的有益菌[42,52,53]。
上述的体外促生能力试验包括:①测定促进植物生长的一些激素(如茁长素、赤霉素、细胞分裂素和生长素等);②1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶,1-Aminocyclopropanecarboxylic acid)活性检测,该酶能降解乙烯前体ACC,从而降低植株体内乙烯的水平,促进根系发育[54];③溶磷能力测试,细菌的溶磷能力有助于植物吸收磷素[55];④产嗜铁素能力测定,能帮助植物吸收铁质[56];⑤固氮能力测定[31];⑥测定细菌产生某些能降解病原真菌细胞壁的酶(如几丁质酶或β-1,3-葡聚糖酶)[52]。
通过体外促生能力筛选PGPR是一条可行途径,但也存在一定局限性。一些菌株的生化途径是诱导型的,也就是说,一些功能在某一环境条件下是表达的,但换个环境或改变某个培养条件就不表达了。因此,试验中往往会出现一些PGPR菌株在实验室条件下是有效的,但在根际条件下却失去这种作用。比如,一些与土壤磷素或铁质等养分相关的PGPR,往往在土壤磷素或铁质含量丰富的情况下作用不明显。
还有一个问题值得关注,一些具有抗病能力的细菌在传代过程中,由于该菌产生的特异性转化酶(Site-specific invertase)容易使其发生“相位变异”(Phase variation),当发生这种情况后,细菌的某些表型会发生重大变化。这也是一些细菌在实验室条件下表现出PGPR特性,但一段时间后,促生能力却消失的原因之一[57]。
筛选工作之后,对体外试验获得成功的PGPR菌株还应该在实际植物生长过程中起到相同的作用。值得注意的是,PGPR往往对不同的植物所起作用不同[58],但具体原因至今仍不清楚,此外PGPR在根际的竞争机制也不十分明了。接种PGPR可能会改变根际微生物群落,这有可能对植物间接促生[59]。当然,接种PGPR也不一定会改变根际微生物群落,也有可能只建立自身的群落,但并不改变根际微生物群落[59]。
最近的一些关于PGPR筛选的报道,都遵循上述策略。Kumar等[60]从生长在贫瘠土壤的番茄根际分离出细菌,再通过解磷、产IAA、产HCN、产嗜铁素、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性测定,确定多株细菌具有促生潜力,并在随后的芝麻种植中进一步试验,确立1株细菌(Pseudomonas aeruginosa LES4)具有明显促生能力;Jha等[61]采集低氮土壤的水稻根际土壤,用不同碳源和不同pH的无氮介质进行富集培养,从中筛选出多株固氮细菌;Ahmad等[62]则采用3种选择性培养基(Jensen’s medium, King’s B medium, Nutrient agar)分别将不同植物根际土壤的固氮菌、假单胞菌和芽孢杆菌分离出来,再通过上述常用的促生指标逐一进行鉴定,从而分离出目标PGPR。
4 展望
研究者对微生物生态学的研究逐渐趋热,反映了微生物在生态系统中 的重要性。土壤微生物是生物圈中物质能量循环的重要组成成分,在植物根际,这一功能尤为显着。植物通过根际分泌有机物质,高选择性地选择适合其健康生长的细菌,导致根际细菌多样性减少,但却为筛选植物根际促生菌提供了来源。
接种PGPR可能会对根际微生物群落产生影响,由于这种影响关系到PGPR的作用效果,因而需要对此详加研究。另外值得关注的是,由于关系到PGPR和植物的互作关系,PGPR和其他微生物的“对话机制”(如群体感应等)值得进一步研究。
今后需要进一步加强根际微生物生态学研究,这有助于获得一些不同功能的微生物,并帮助人们解决不同的环境问题。未来PGPR生态学研究会越来越多地应用一些先进技术,如DNA/RNA微阵列技术,更好地揭示PGPR结构及功能多样性。此外,为提高PGPR的应用效果,细菌群体感应等机制还有待进一步研究。
微生物论文:不同培肥措施对新建设施土壤微生物产生的影响
自天津市“4412”工程启动以来,设施农业面积逐年增加,加强新增部分设施农业基地土壤科学培肥显得非常重要。传统培肥措施普遍存在不考虑土壤理化性状、生物性状、结构等方面的破坏,只考虑短期效益,盲目大肥投入,培肥效果不稳定[1-3]。土壤微生物在土壤养分分解转化过程中起着不可替代的作用。主要包括了细菌、放线菌和真菌,土壤细菌占土壤微生物总数量的70%~90%,放线菌约占土壤微生物总量的5%~20%。设施土壤与露地土壤相比环境条件发生了很大变化,主要是设施条件下独特的小气候条件和耕作强度,全年条件下高温高湿和含有大量微生物的有机肥的施用都有利于微生物的生长、繁殖,加快土壤养分转化,真正提高土壤肥力水平和土壤生物多样性水平[4-5]。生物有机肥料是农业生产中重要的物质基础,能为作物提供的营养,它肥效长,可以增加和更新土壤有机质,促进微生物繁殖,增强土壤保水保肥能力[6-7]。长期施用化肥,不仅消耗土壤有机质,导致地力下降,而且使单位化肥养分的增产率呈现递减趋势,并引起农产品品质下降。生物有机肥料能明显改善根际土壤微生物环境,显着提高土壤酶活性[8]。连年集中施用生物有机肥可改善作物根际土壤的理化性状,增强土壤生物活性,达到改良土壤、提高土壤肥力的目的[9]。科学合理地施用生物有机肥是保障生产无污染品质蔬菜的一项重要技术措施。笔者以菜瓜作为栽培作物,通过在新建设施土壤上采取多种培肥措施,研究分析了不同培肥技术措施对菜瓜产量、产值以及对土壤微生物数量的影响。
1 材料和方法
2 结果与分析
2.1 培肥措施对产量和产值的影响
2.2 培肥技术肥料成本分析
不同培肥技术措施,投入成本也不相同,具体统计见表4。按照10号棚不同培肥措施分析,生物复合肥与减半量的粪肥和复合肥结合培肥模式产量较高,比常规施肥节省2 220元·hm-2;根据13号棚不同培肥措施分析,秸秆还田、堆沤粪肥、生物复合肥和配方肥集成措施增产效果十分突出,比常规施肥模式肥料投入成本仅仅高2 400元·hm-2。
2.3 培肥技术对土壤微生物数量的影响
针对堆沤粪肥、商品有机肥、秸秆还田、生物菌肥等不同培肥措施,对土壤细菌、真菌、放线菌总数进行调查分析,具体结果如表5。
根据对新建后种植一茬的土壤微生物总量分析结果,不同的培肥处理细菌和放线菌总数增加明显,这与有机肥的使用、秸秆还田、土壤剖面性状的改善及通透性的改善有关。培肥后细菌增加了2~3倍左右,放线菌增加了10倍多。根据不同培肥措施来比较:秸秆还田+堆沤粪肥+生物复合肥+配方肥综合培肥措施,对土壤微生物数量影响较大。土壤中的微生物种类繁多,数量极大,1 g肥沃土壤中通常含有几亿到几十亿个微生物,贫瘠土壤每g也含有几百万至几千万个微生物,微生物种类和数量越多,土壤越肥沃。通过培肥的施用,土壤中的微生物成倍的增加,有助于腐殖质、有机质的形成,腐殖质分解,释放出其中的养分供植物吸收利用。土壤中的真菌有许多能分解纤维素、木质素和果胶等,对自然界物质循环起重要作用[10]。
3 结论
(1) 西青区王稳庄镇新建设施基地土壤,耕层浅,耕层土壤有机质、全氮、全磷、有效磷含量较低。
(2)针对新建设施,通过在菜瓜上采取施用配方肥、秸秆还田、施用有机肥等培肥措施示范比较,减半量的生物复合肥、堆沤粪肥和复合肥结合培肥模式比常规施肥增产2 430 kg·hm-2、节本增效3 825元·hm-2,秸秆还田+堆沤粪肥+生物复合肥+配方肥集成措施比常规施肥模式增产23 610 kg·hm-2,节本增效15 705元·hm-2。
(3)本试验培肥后,土壤细菌增加了2~3倍左右,放线菌增加了10倍多,根据不同培肥措施来比较:秸秆+堆沤粪肥+生物复合肥+配方肥集成培肥措施对土壤微生物数量影响较大。但是,值得探讨的是,农民对生物有机肥和普通有机肥不认可的原因在于单一生物肥与化肥结合作底肥,效果一般的原因在于新建设施基地土壤质地较差,土壤通透性低,保肥保水与供肥能力差,根据试验分析可见,新建设施土壤培肥不能单纯依赖商品生物肥或有机肥来改善土壤结构,应当适当配合增施一些畜禽粪肥以提高商品有机肥或生物肥效果的发挥[11-12]。
微生物论文:浅析微生物采油技术的发展前景
自从20世纪20年代美国人Beckman提出利用微生物提高原油产量的想法,到50年代矿场试验成功,美国对生物采油技术的发展做出重大贡献。50年代末到70年代,此项技术在前苏联和东欧一些国家取得了较为显着的进步。目前,美国和俄罗斯是微生物采油技术的两大研究阵地,二者都主张将微生物代谢的产物作为驱油剂使用,从而提高石油采收率,但又有所不同。美国侧重于培养筛选菌种注入油藏,在实际应用中绝大多数项目都是成功的,并在两次微生物采油经济评价中,分别使石油产量增加百分之十三和百分之十九点六。俄罗斯主张利用营养物激活原油本源微生物,大量的矿场试验表明这种方式效果十分显着。相较而论我国微生物采油技术起步较晚,60年代,胜利油田曾经开展过微生物采油的相关研究,但后来很可惜因种种原因没能够坚持到底而中途夭折。进入90年代后,方呈现出一片繁荣的景象,无论是理论实验还是实际应用都取得了巨大的进展,总体技术已经接近国际先进水平,吕振山等学者利用聚合酶链式反应技术(利用DNA在体外摄氏95度时解旋,55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至72度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链,放大特定的DN段,可看作生物体外的特殊DNA复制)对多种微生物进行基因检测,并对菌种的油藏适应性、增殖地下运移能力、和增采能力进行了的认证;微生物驱油的数学模型在雷光伦等学者的努力下也初步实现了化和完整化;采油微生物代谢物及其分析研究也取得了可喜的成绩,包木太等学者用力甚勤,中国有望后来居上,成为微生物采油技术最为先进的主要国家之一。
微生物采油技术标准
菌种选择标准。菌种筛选是微生物采油技术的关键,菌种选择的优劣将直接影响到采油效果的实现。目前使用的方式主要有培养基因工程采油菌和筛选自然采油菌两类。就国内情况来讲,早期目标是筛选出能够适应地层环境的菌种,它们可以提供适当的有机营养物,使微生物的生长代谢产物可以起到驱除地层中残油的作用就可以。随着技术的不断进步,菌种筛选要求亦越来越高,菌种耐温性得到较大的重视,这是因为耐温性能越好,其适用的油藏范围越广;菌种应耐矿化度,降低营养物成本。油藏环境标准。微生物的正常生长是在一定的环境条件进行的,不同的油层条件需要配置不同的微生物溶液,同样采用微生物技术也需要满足特定的油藏环境标准,主要包括温度、深度、压力、矿化度、渗透率等,有学者已统计出选择微生物处理的油层条件,在此列出,以备参考。
未来研究前景
微生物采油技术含量较高,同时也是一门新兴的交叉学科。在未来的科学研究中,笔者建议:首先,注重提高采收率的机理研究。微生物采油应用技术正日臻完善,驱油机理方面的研究尚有欠缺,仍有进一步发展的必要。其次,微生物采油数学模型的研究亦有待深入,开发模型软件,建立系统的微生物与盐水相互作用研究体系,加强微生物在孔介质中的运动规律研究。再次,加强与其他学科的交叉研究。微生物采油技术涉及到生物、石油、地质、化学等多学科的知识内容,因此,需要有关学科的专家通力合作,共同发展,相互帮助,最终使微生物采油技术的发展得到质的飞跃。(本文作者:张洪林 单位:中油国际阿克纠宾油气股份公司)
微生物论文:分析微生物燃料电池知识引入高中化学
【关键词】引入,高中,化学,知识,电池,燃料,分析,电子,微生物,传递
微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC)是利用微生物的催化反应将化学能直接转化为电能的装置,其基本构造与普通燃料电池类似,如图1所示。微生物燃料电池的阳极通常选用导电性能较好的石墨、碳布和碳纸等材料,阴极则大多使用载铂碳材料。保持阳极池无氧,阴极池有氧,两池之间的阳离子半透膜使H+自由通过,氧气不能通过。连接两极的外电路中串联电阻器或其他电子设备[1~3]。
图1 微生物燃料电池构造示意图
与传统燃料电池不同的是,微生物燃料电池的阳极反应是靠微生物催化氧化有机物(底物)而产生电子和质子。电子通过导线传递到阴极,质子通过半透膜渗入阴极池。阴极池中,氧气、质子、电子反应生成水。常用葡萄糖作为底物,反应如下[4]:
阳极反应:C6H12O6+6H2O6CO2+24e-+24H+
阴极反应:6O2+24e-+24H+12H2O
电池反应:C6H12O6+6O26CO2+6H2O
2 微生物燃料电池的产电机制
微生物燃料电池的产电过程可分解为5个步骤:(1)底物生物氧化:阳极池中,底物在微生物作用下被氧化,产生电子、质子及代谢产物;(2)产生的电子从微生物细胞传递至阳极表面;(3)电子经外电路传输至阴极;(4)产生的质子穿过半透膜,从阳极池迁移至阴极池,到达阴极表面;(5)阴极池中,电子受体(如氧气等)与迁移来的质子和电子在阴极表面发生还原反应。通常,前2个步骤是限速步骤,即电子的产生与传递效率是影响MFC输出功率的最重要因素[2,5]。
2.1 底物生物氧化
2.1.1 产电呼吸代谢[5,6]
微生物在无氧的阳极池中会发生产电呼吸代谢,即通过呼吸代谢过程产生电子、质子及代谢产物。微生物的代谢途径决定电子与质子的流量,它与底物有关,而阳极电势也对它起着决定性作用。
阳极电势较高时,微生物经呼吸链进行代谢,电子和质子通过NADH还原酶、辅酶Q及细胞色素进行传递;阳极电势较低,且存在硫酸盐等其他电子受体时,电子会在这些电子受体上累积,而不与阳极反应;当不存在硫酸盐、硝酸盐和其他电子受体时,微生物主要进行发酵,代谢过程也会释放少量电能,同时醋酸等发酵产物可被某些微生物继续代谢,释放电子。
2.1.2 阳极微生物
阳极微生物的种类决定阳极的电子传递方式,如表1所示。理论上各种微生物均可用于MFC,但由于细胞壁中的肽键等不良导体的阻碍,大多数微生物产生的电子不能传出体外,因而不具有直接的电化学活性。通常采用添加可溶性氧化还原介体作为电子传递中间体的方法,实现电子由细胞内传递至阳极表面。此类MFC称为间接MFC(或有介体MFC),其工业化应用由于介体大多有毒、易流失、价格较高而受到很大阻碍[2,7]。
微生物通过代谢活动能产生一些自身生长和繁殖所必需的物质,如氨基酸、核苷酸等,这些物质称为微生物的初级代谢产物。一些微生物能以产生的H2、H2S等初级代谢产物作为氧化还原介体,例如Harbermann等设计出利用Desulfovibrio desulfurcan菌种生成的硫化物作为介体的微生物燃料电池。该系统不经任何维护连续可运行5年,其电池反应如下[1]:
2+2H2O2CO2+8H++8e-
代表有机燃料
SO2-4+8H++8e-S2-+4H2O
阳极反应:S2-+4H2OSO2-4+8H++8e-或8/3S2-+4H2O4/3S2O2-3+8H++8e-
阴极反应:2O2+8H++8e-4H2O
有一些微生物(如绿脓杆菌)自身能生成易还原的次级代谢产物,影响电子传递。次级代谢产物指以初级代谢产物为前体合成的,对微生物的生命活动无明确功能的物质。
近年来,研究者发现了多种不需介体就可将代谢产生的电子通过细胞膜直接传递到电极表面的微生物——产电微生物。此类微生物以位于细胞膜上的细胞色素或自身分泌的醌类物质作为电子载体,将电子由细胞内传递至电极上,这种MFC称为直接MFC(或无介体MFC)。
2.2 阳极还原[2,8]
阳极还原指电子由微生物细胞内传递至阳极表面,是电池产电的关键步骤,也是制约产电性能的主要因素之一。常见的阳极电子传递方式主要有4种:直接接触传递、纳米导线辅助远距离传递、电子穿梭传递和初级代谢产物原位氧化传递。前2种属于生物膜机制,后2种属于电子穿梭机制。2种机制可能同时存在,协同作用,促进产电过程。
A直接接触 B纳米导线 C氧化还原介体D还原态初级代谢产物原位氧化
图2 微生物燃料电池阳极电子传递机制示意图
2.2.1 生物膜产电机制
生物膜产电机制指微生物在电极表面聚集形成膜,通过直接接触或纳米导线辅助作用而转移电子。这是一种无介体电子传递机制。
直接接触传递指与阳极表面接触的产电微生物菌体可通过细胞膜外侧的C型细胞色素,将呼吸链中电子的直接传递至电极表面,如图2A所示。该方式只是紧靠电极表面的一单层微生物可传递电子给电极,因此电池性能受限于电极表面这一单层微生物的较大细菌浓度。
近期研究表明,某些细菌的细胞表面存在一种可导电的纳米级纤毛或菌毛,起到电子导管的作用,依靠这些纳米导线辅助,可进行远距离电子传递。这些表面纤毛的一端与细胞外膜相连,另一端与电极表面直接接触,将细胞外膜上的电子传递至电极表面,实现电子转移,如图2B所示。这些菌毛可使电子传递到离细胞表面更远处,进行较远距离的电子传递,从而可形成较厚的具有产电活性的生物膜,提高电池性能。
2.2.2 电子穿梭产电机制
电子穿梭产电机制指微生物利用外加或自身分泌的电子穿梭体(氧化还原介体),将代谢产生的电子转移至电极表面。根据介体的不同,有介体电子传递可分外源介体的有介体电子传递、还原态初级代谢产物原位氧化传递、微生物次级代谢物为介体的电子传递。
外源介体的有介体电子传递过程如图2C所示。底物在微生物作用下被氧化,进入微生物细胞内并处于氧化态的介体捕获释放出的电子而被还原,处于还原态的介体被微生物排泄出体外,在阳极表面失去电子被氧化,从而将电子传递到电极上。
自身可分泌具有电子传递功能的氧化还原介体的微生物,主要将代谢物作为介体来进行电子传递。其中,以次级代谢物为介体进行电子传递的MFC,消除了添加外源介体带来的各种问题,引起特别关注,其传递过程也可用图2C表示。在微生物体内分泌产生的氧化态次级代谢物作为可逆的末端电子受体,将电子传递至细胞外,在阳极表面发生电子转移,还原态介体重新被氧化,进入下一氧化还原过程。另有一些微生物能以代谢过程中产生的如H2、H2S等初级代谢产物作为氧化还原介体进行电子传递,如图2D所示。作为阳极氧化的还原剂,初级代谢物介体需要满足一些条件,即氧化还原电势应较低,但不能低于底物的氧化电势,且在MFC中易于电化学氧化。
微生物论文:对环境工程微生物实验教学改革的探索
环境工程微生物学是环境工程专业学生必修的专业基础课程,是一门实践性很强的应用学科。实验课是环境工程微生物教学的重要组成部分,它是培养和训练学生的实验操作能力、独立分析问题、解决问题能力的重要环节。环境微生物的一些基本技术如无菌操作、培养基制备、消毒与灭菌、微生物的培养分离计数等在环境污染处理的应用领域中应用十分广泛。随着生物工程技术的发展,现代生物技术如基因重组、PCR技术也在环境工程得到应用。近年来我国高等教育规模急剧扩张,教学实践资源日趋紧张。如何改革环境工程微生物学实验的内容及授课方式,一直是大学环境类课程建设的重要内容。近年来,我们对环境工程微生物的实验教学进行了改革探索,目的是进一步提高环境工程微生物学实验教学效率,培养具备理论知识扎实、动手能力强的大学毕业生。
1?改革实验课程的设置
我们将过去独立、互不相关的微生物实验改为一连续的探索性的大实验,开设了一门“环境工程微生物综合训练”的独立课程。课程放置在学期结束时的实践周中进行,集中对学生进行微生物的培养、分离、鉴定和污水处理应用的基本操作的训练过程,这样强化了对学生基本技能和动手能力的培养。综合训练的主要内容包括:首先在制备各类培养的基础上,采取不同的环境样品中进行接种、培养,通过菌落和个体形态观察,纯化细菌、放线菌或霉菌和酵母菌,然后学生以自己分离、纯化的菌种为材料继续进行以后的实验,在对细菌形态观察、革兰氏染色和菌体大小测定基础上,做细菌的生理生化试验,对细菌做出初步鉴定,并将分离出来的细菌用于生活污水的处理上。环境工程微生物综合训练的主要实验内容和所涉及的知识点见表1。改革后的综合训练使原来孤立、不连续的实验形成一个连续的整体。在微生物的菌种的培养和分离,纯种的计数和鉴定等方面强化了学生的实验技能。各种基本操作技能在微生物综合训练中多次操作,反复应用,能大大提高学生的微生物技能的综合应用能力。
验证操作性实验相对较多,设计性、综合性实验相对较少是目前实验课程教学中的突出问题,这对培养实用型人才极为不利,也不利于调动学生的学习兴趣和积极性。我们将一些应用性、综合性和学生感兴趣的实验课题,作为选作实验,供感兴趣的学生通过查阅相关资料,综合运用不同实验技术,设计实验方案,通过教师指导和小组讨论确定方案并加以实施。实验后综合分析实验结果,撰写科创论文。比如,“微生物诱导腐蚀”的选作实验,主要是研究研究厌氧微生物对金属腐蚀过程,使同学们扩大对微生物环境作用的了解,增强学生的学习兴趣和实践动手能力。这样,既能提高学生对实验的兴趣,又能促使他们将所学的理论知识应用起来,从而加深对环境工程微生物课堂教学内容的理解。(如表1)
2?重视视频实验教学的应用
微生物个体微小,学生对它的感性认识不多,这使得许多有关微生物的概念变得抽象、难以理解。在实验教学中,有目的的引入了视频实验等多媒体教学的方法,可以增加实验教学的直观性和趣味性,并在一定程度上弥补实验教学经费紧张等问题。我们不仅制作了环境工程微生物的多媒体课件,而且采用视频教学短片,向学生展示基本的实验操作,以及相关实验技术的发展及其在生产或科研中的应用。这些改革以视频的形式向学生展示实验的基本过程,具有较强的直观性,通过屏幕清晰形象地展现每一个步骤,使学生掌握实验操作技能的关键所在加深了学生对使微生物的实验规程和操作技巧理解,如无菌操作技术、微生物的分离和培养技术、消毒灭菌技术、斜面、液体、平板接种培养方法等。采用多媒体进行实验教学,具有形象、生动、信息量大的优点,结合教师在实验过程中的讲授和示范,有利于学生在脑海里建立每一种实验操作的标准和规范。因此应该加强多媒体在环境微生物学实验教学中的应用。
3?强调实验前的准备工作
传统的实验课程教学方法是由实验教师帮助学生完成很大一部分准备工作,学生只是按教师的讲解和实验手册的步骤进行操作。我们在微生物综合训练中,改变实验课中讲解过多的现象,只是重点讲述实验成功的关键并事先提出思考题,让学生们带着问题去进行实验,让学生通过实验归纳出结论,从而理解和验证微生物学的基本原理。教师在实验中起指导作用,着重培养学生的动手能力。由于综合实验涉及的内容很多,所以我们要求学生先复习以前学过的知识并写出实验计划(包括实验目的、原理、仪器、材料、步骤),然后在课堂上对实验计划进行讨论,讨论后学生再进行修改,由教师审定。审定合格后,学生方可开始进行实验,这是可以提高学生的实验培训的主动性。实验从实验材料的准备到每一步实验都由学生自己动手,教师只起检查和辅导示范作用。让学生明白每个实验步骤操作的好坏对后续实验的进行有直接的影响,培养学生整体的实验观念和细心的操作习惯。由于是学生自己进行实验的准备工作,可以加深对实验的目的、原理、方法、步骤的了解,实验效果很好。
4?改革实验课程的考核形式
综合训练的考核是既是课程设置的要求,也是对学生实验技能学习的一种督促和检查。在微生物综合训练中,我们将学生4~5人分为一小组,同一组的每位学生既有分工又有合作,每位学生都独立进行无菌操作、接种培养等工作。在材料的准备和实验完成的整个过程中,任何一个步骤的失误都将直接影响最终结果,因此我们要求每位学生规范操作,仔细观察,及时记录,培养严谨的科学态度和独立操作能力,老师对每位学生的操作和实验结果都做出客观的评价。将综合训练考核分为预习 、操作、实验报告三部分记分。在实验过程中,进行现场指导,当场考核,不仅要看实验报告,更要依据预习、现场实验操作和实验结果综合考核。在操作考核中既有单独的个人操作考核,也有分组的操作考核。实验报告要实事求是,严格杜绝相互抄袭现象。要求学生在实验报告中对实验过程和结果进行详细记录和分析,养成一个善于分析问题和总结问题的好习惯。实验报告中的分析与讨论是很重要的内容,我们鼓励学生在分析讨论中自由地写出自己对实验的理解,比如哪些操作步骤没有做好,或者在实验过程中容易出现什么问题,如何避免等,还可以提出对实验设计修改的建议。通过对实验问题和结果的分析、讨论,可加强学生对理论知识的理解,大大提高学生分析问题和解决问题的能力。
通过这些改革措施,使学生能够认识到实验课的重要性,同时也提高了实验课的地位和学生的积极性,教学质量有较大的提高,为环境工程专业后续课程教学的展开和将来毕业论文的顺利完成打下基础。
5?培养工程实践观念
我校是具有电力特色的地方性高等学校,环境工程专业是从电厂化学专业基础上衍生和发展起来的。我校环境工程专业的课程设置强调重工程、重实践的专业特色。环境工程微生物学需培养学生分析和解决环境工程问题的思维模式,要使学生了解微生物在环境污染物治理中的作用原理,而不是仅仅停留在微生物学本身基本的实验操作上。我们在微生物综合训练课程设计中特别注意结合工程应用问题,充分围绕教学队伍的科研课题及实习单位的生产展开,注重培养学生的工程实践能力。我们根据本专业教师承担的科研项目,通过课题的形式,组织一些对环境工程微生物感兴趣的学生,参加到教师的科研项目中。一些老师在设计新的污水处理工艺时,经常会有很多项目指标需要测试,只要合适,我们也将样品拿来让学生在实验教学中做。这样就培养了学生从工程角度思考和解决实际问题的能力。
我们学校毗邻上海东区污水处理厂,上海东区污水处理厂是亚洲建造最早的污水处理厂,也是目前我国的仍在稳定运行的建于20世纪20年代的污水处理厂,采用活性污泥法的二级生化处理工艺,其基本原理和设计思路已经成为当今城市污水处理的理论经典和工艺核心。上海现有十余座污水处理厂的处理工艺均是在此基础上的调整或演化。我们组织学生在上海东区污水厂实习,并对不同运行工况下的微生物进行监控,使学生们掌握实际工作中所涉及的微生物的知识和测试技术,深刻了解污水处理工程应用过程中微生物的作用。
总之,这些改革探索,主要的目的是增加学生实验的主动性,培养学生积极思考的习惯,将一些操作性实验结合在探究性训练中去,提高了综合运用知识、分析和解决问题的能力,培养了严谨、钻研、科学的学风。这也对教师提出了新的要求,也就是不断开发新的探究性实验课题,满足对学生实践和动手能力的培养,适应环境工程微生物课堂教学发展的要求。
微生物论文:简述微生物学双语教学的实践与思考
论文关键词：微生物学 双语教学 实践
论文摘要：微生物学是高等学校生物类专业的重要基础课程之一，学好微生物学将为进一步学习其他专业课程奠定坚实的微生物学基础。微生物学科发展日新月异，为使学生跟踪发展前沿，提升学生对英文的使用能力和综合素质，高等院校应推行微生物学双语教学，并应加强在教学体制改革、条件建设等方面的工作。
微生物学是高等院校生物类专业的重要基础课程之一，学习好微生物学将为进一步学习其他专业课程奠定坚实的微生物学基础[1]。微生物学科发展日新月异，为使学生跟踪学科发展前沿，提升学生对英文的使用能力和综合素质，我们从2004年开始进行微生物学双语教学的尝试，取得了较好的效果，并获得了一些有益的启示。
一、微生物学的双语教学实践
1.关于教学大纲和教学内容
本课程总学时为54学时，其中理论课36学时，实验课18学时。本课程为双语教学课程，旨在为学生打下牢固微生物学基础，培养学生使用专业英语的能力，为学生阅读英文文献和进行学术交流奠定良好的语言基础。课程内容包括微生物形态、生理、生长、遗传变异、生态以及微生物与自然界物质循环关系5个方面。在内容的选取方面，以周德庆主编的《微生物学教程》（第二版，高等教育出版社，2001年）为基础，结合J. Nickllin等主编的Microbiology（影印版，科学出版社，2003年）以及笔者留学加拿大麦吉尔大学带回的该校微生物学讲义内容，既照顾到国内微生物学教学的传统体系，也同时吸纳了国外同类课程的长处。
2.教材的选用
2004年实施双语教学之初，由于没有合适的教材，为了应急，以J. Nickllin等主编的Microbiology为教材，但是该教材的内容和教学体系毕竟与我们现行的体系存在差异，因此，教材的使用效率比较低较，只有部分章节被利用。另外，原版教材价格较高，加重了学生经济负担。针对这种情况，我们于2005年着手自编微生物学双语教学教材，该教材的特点是吸收了国外同类教材的优点，紧紧结合教学内容，与教学进度同步，重点突出，条理清晰。另外，我们将教学内容和课堂笔记融入教材，使教材同时起到教学参考书和笔记的作用，学生在课堂上可以“以划代记”，省去记笔记的时间，集中精力去理解和掌握教学内容。与该教材配套的参考书有周德庆主编的《微生物学教程》和J. Nickllin等主编的Microbiology。
3.关于课堂教学
授课之前布置预习作业，督促学生对授课内容和专业词汇提前预习，做到心中有数，有针对性地去听课。课堂教学语言的使用根据学生的理解状况随机调整，一般课程开始阶段英文使用频率低，随着学生理解能力的增强，逐步增加英文的量，减少汉语的量，在内容浅显易懂的章节，则全部采用英文。全部课程采用多媒体授课，多媒体内容绝大部分是英文，在多媒体制作时，尽可能多地采用表格、图片、动画等手段，将抽象的教学内容生动化、直观化，帮助学生理解授课内容。同时多媒体课件上载到校园网，学生可以随时随地上网查看学习。一般，在用外语授课以前，用汉语将授课内容梗概做以简单描述，使学生在基本理解专业知识原理的前提下再花大气力用外语授课，这样会起到事半功倍的效果。针对教学内容和专业词汇布置课后作业，结合课下答疑和辅导，学生可以基本消化和掌握授课内容。
4.关于双语教学研究
在我国高等院校双语教学还是一个新鲜事物，在双语教学的实践中必然面临许多困难，需要我们抱着一个探索和研究的态度去实践，不断发现问题、解决问题、积累经验、创新发展。因此，有必要对高等教学中双语教学的规律进行专门的研究。笔者结合自身双语教学的实践先后主持了4项双语教学项目的研究和建设任务，通过教学项目的开展，提升了自身的理论水平和教学水平，起到了教学研究和教学实践相互促进、相互支撑的作用。
二、高校双语教学存在的问题与思考
1.对双语教学的认识上的误区。
目前，虽然我国高等院校中多数开设了双语教学课程，但在高校中也存在对双语教学的重要意义认识不足的现象。主要表现为，针对双语教学的鼓励性政策较少、对双语教学的投入远小于实际需求，与双语教学相配套的改革措施少、双语教师的培训力度不够等。国内外的经验告诉我们，双语教学是让学生精通掌握外语的有效途径，要想彻底打破我国外语教育中“投入多、产出少”以及“高分低能”的尴尬僵局，双语教学无疑是一条可以借鉴的成功之路，双语教学对于中国高等教育的重要意义毋庸置疑，我们必须在这一点上统一认识，坚定不移地推动双语教学的进程。当然，我们也应该充分认识到双语教学事业的艰巨性和长期性，认识到双语教学是一项系统工程，需要社会各方面的共同努力才能完成。我们应避免盲目乐观和急于求成的思想，要脚踏实地地推进工作，充分预料到可能遇到的困难和挫折，直至取得成效。
2.双语教学与现行教育体制在一些方面存在冲突。
双语教学与现行外语教学的冲突。在高校教学计划中，双语教学科目所占的学时数一般与该科目正常学时数一致，由于学时的限制，双语教学很难达到“制造语言环境、用外语熏染学生”的教学效果，常导致教学效果不尽人意。而如果大规模开设双语课程，在强调双语教学的同时，势必会在学时分配、成绩考核方式等方面与常规的外语教学产生冲突，因此，我们应该协调两者关系，考虑适当扩大双语课程范围并增加学时[2]。
学生外语水平与双语教学的冲突。目前，我国高校学生英语的听说能力普遍较差，多数学生应付日常的外语会话尚有很大困难，更不用说去难理解双语讲授的学科理论知识。我们应该采取一些灵活机动的方式去实施双语教学，比如，可以采取分类教学。根据学生的外语水平将学生分成不同的班级，对外语听说能力较强的学生实施双语教育。而对于外语基础差、不能适应双语教育的学生不宜勉强，应对其实施普通的母语教育[3]。
硬件条件不足与双语教学的冲突。我国高校中的各种教学设施和教学条件都是为开展汉语教学而设置的，而开展双语教学所需要的教材、参考资料、音像资料、教具等条件几乎很少有现成的，开展双语教学的教师必须自己创造条件，开出一门双语教学课程教师所付出的劳动远超出一般汉语课程。
微生物论文:现代临床微生物学在感染控制中的作用
【关键词】 微生物学 感染控制 作用
现代临床微生物学是一门由临床医学、基础医学和预防医学相结合的交叉学科，又是检验医学中重要和成熟的专业之一。这门新兴的学科需要微生物医师和实验技术人员联合进行工作，具体任务有四项：①对微生物标本做出快速、的检验报告，及时满足临床的需要；②进行有关抗菌药物耐药性方面的各种试验，受理抗菌药物合理应用的咨询；③密切结合临床，与临床医师讨论、研究及处理有关感染性疾病的问题；④参与抗菌药物临床合理应用的管理和医院感染监测、控制和管理［1］。这就要求临床微生物工作者不仅要完成实验室工作，还要完成有关的临床工作，成为感染控制和抗菌药物临床应用的参谋和顾问。
1 病原学诊断
1.1 病原学诊断的基本要求
1.1.1 确保临床标本:恰当的标本采集是感染性疾病诊断的最为重要的一个步骤。要求临床医师正确采集能代表感染部位的临床标本，广泛采用保护性试子、合格的容器及安全运送培养基，避免标本中的微生物受毒性物质作用而死亡。
1.1.2 了解机体的正常菌群：了解人体的正常菌群是细菌检验的必要前提，要了解正常菌群的概念、分布和种类，条件致病菌与内源性感染、菌群失调症与二重感染的概念，既不要将所有标本分离出来的细菌都当成致病菌，也不能将正常寄居菌所导致的内源性感染轻易放过。
1.1.3 三定一结合：分离鉴定时要做定性、定量和定位分析，并结合病情。要求根据临床和标本的具体情况确定检验程序，选择培养基及合适的鉴定试验。要判断分离出的细菌是致病菌、条件致病菌、还是非致病菌（定性），同时要有一个细菌数量的大致估计，必要时进行半定量和定量培养。在人体有菌部位分离的细菌，其意义大小要参考微生物的定性和定量分析作出判断；如在无菌部位（如血液、脑脊液）分离出细菌，无论是何种微生物和数量多少，均具有重要意义（定位分析）。在进行“三定”分析时，一定要结合病情，观察是否与病情相符。
1.1.4 提供快速、的病原学诊断：在临床医师提供病人的临床诊断信息和适当的临床标本，并尽可能获得流行病学资料的情况下，进行微生物检验和药敏试验，要求及时、地分析检验结果，为临床提供的病原学诊断以便对病人作出恰当的处理。尽管目前微生物的分离鉴定仍作为病原学检测的金标准，但这种“以活菌生长”为基础的传统的细菌学鉴定方法速度较慢，不能适应临床的需要，要求以标本的直接检查为基础，如形态、染色、抗原检测及核酸检测（核酸杂交、PCR和16SrRNA分析），检测致病基因（致病岛、毒力岛）和耐药基因。尽可能在快速诊断方面下工夫。
1.1.5 及时报告：要使实验室数据有效地转化为临床有用的信息，病原微生物诊断报告应实行三段报告制度，即在涂片或培养阳性结果出现时、敏感试验结果出来时以及最终结果出来后都要及时报告。
1.1.6 加强质量控制，增加检验项目：临床微生物室必须加强质量控制，保障各种标本的检验质量，为临床提供依据，并满足临床需要的各种检验项目。当前临床微生物实验室应根据本单位的实际情况增加检验项目，临床要求关注的一些项目有：①呼吸道标本的细菌学筛选和半定量培养方法；②呼吸道非典型病原体的检测，包括衣原体、支原体和军团菌；③非结核分枝杆菌的培养和药敏；④免疫抑制或器官移植患者特殊病原体的检测，如巨细胞病毒，卡氏肺孢子菌等；⑤抗生素相关腹泻的病原体（主要是艰难梭菌）的检测；⑥侵袭性真菌的快速检测和药敏试验等。
2 密切联系临床，参与临床会诊和感染病例讨论会
2.1 获取临床信息，做出及时、的微生物报告：临床感染性疾病往往涉及多种病原体，没有任何一个单一的试验能够检出所有潜在病原体。因此，临床信息是选择试验方法的重要参考依据。临床医师在开化验单时应写明有关病人的推测性诊断，以便实验人员能据此选择合理的检验程序和试验方法，并能指导临床正确采集恰当的标本；当实验室开始有实验结果时，必须及时通知临床医师，以便让他们重新评价诊疗方案。
2.2 疑难微生物报告的解释与咨询：近年来，不少感染性疾病特别是医院感染的病原谱和药敏谱发生很大变化。以往罕见的微生物频频出现在检验报告单上，药敏试验的方法、受试品种、结果解释也有不少改变。临床医师常常难以正确理解和利用临床微生物检验资料。面对这一现状，临床微生物室应积极与临床沟通，帮助解决临床医师在判断微生物检验和药敏结果报告单时的困难。指出正常菌群、污染菌和感染菌的鉴别与判断少见菌或罕见菌的意义；培养阴性时的可能原因；药敏试验结果的判断标准和局限性；特殊耐药细菌的耐药特点等，必要时在报告上增加注解。
2.3 设置微生物医师，作为临床与微生物室沟通的桥梁：目前国外不少医院均有临床微生物专家或检验医师的会诊、咨询制度［2］。如检验开始时发现图涂片有问题，即由检验医师主动与临床联系，共同讨论涂片所见的意义。每天微生物室的医师与技师在一起看培养和药敏结果，尤其是痰培养结果要与直接涂片核对，发现问题及时与病房联系。建议临床微生物室每日有一位医师参加本院感染科、呼吸科或ICU的晨会，并回来向科内医师汇报有关感染病人情况。或定期派出医师带上有关检验结果，参加一些临床科室的感染问题讨论会，具体解决感染症的治疗问题［3］。如定时参加ICU、肿瘤科、神经外科、儿科等的讨论会，对血培养阳性、脑脊液检查阳性或严重烧伤感染的病人，微生物医师要主动去病房看望，参加治疗方案讨论。对菌血症或脓毒血症病人要协助找出原发症灶。临床微生物医师巡视病人后要在病历上记录意见，必要时可与临床的主管医师、主任一起讨论。各临床科室如有感染问题可与临床微生物室联系，询问检验报告的意义或要求会诊。微生物室每周召开一次感染病例讨论会，讨论感染病人的情况，交流发现的问题，并将临床微生物室的意见与临床科室进行交流。微生物室医师也要参与日常检验工作，并接受临床有关微生物学问题。
3 参与抗菌药物临床应用的管理
合理应用抗菌药物，减少或避免耐药菌株产生，是当前抗感染领域的一大难题，临床微生物室在抗生素合理使用中起重要作用［4］。首先要重视感染的病原学诊断。临床医师在使用抗菌药物前，应采集多份微生物学标本做细菌培养和药敏试验，微生物室则为临床提供快速、的细菌检验和药敏结果。此外，微生物专家与临床医生密切联系并参与患者的治疗也是控制抗生素用量的重要方法。微生物专家应参与医院药事委员会，参与制定抗生素使用指南、教育和培训、监督和检查等。这方面香港马丽医院的做法是由感染监控护士负责走访感染病例，发现抗菌药物误用或不合理应用时，由微生物室主任出面向院长、当事科室主任和当事人反馈，取得较好效果。
4 参与医院感染的监测、控制和管理
我国《医院感染管理规范》明确指出检验科在医院感染管理中应履行以下职责：负责医院感染常规微生物学的监测；开展医院感染病原微生物的培养、分离鉴定、药敏试验及特殊病原体的耐药性监测，定期总结、分析向有关部门反馈，向全院公布；医院感染流行或暴发时，承担相关检测工作。
临床微生物实验室在医院感染的监测、控制和管理中的作用包括：①加强病原学监测，作为判定医院感染的基础；②加强耐药性监测，以指导合理使用抗菌素；③加强环境、器械等微生物学调查，以达到卫生学指标要求；④保障医院内消毒、灭菌的质量；⑤通过流行病学调查和细菌学分型试验，追踪感染源并加以控制［5］。
4.1 加强监测：临床微生物室是医院感染控制委员会的必然成员，微生物检验在医院感染的监测中起重要作用。若在临床微生物检验中发现有医院感染问题，要及时与医院感染控制部门、病房医师和护士联系，并注意发展动态。医院感染中的一些特殊耐药菌如GRE、MRSA、产ESBL肠杆菌科细菌等常通过交叉感染传播，曲霉菌、军团菌等常在空调、供水系统、雾化装置存在并导致感染，对可能携带这些致病菌的来源常规监测并提醒临床注意，通常可有效预防传播扩散并节省大量抗感染费用［6，7］。
4.2 医院感染的教育和培训：临床微生物室要参与有关人员的医院感染教育和培训工作。如讲解临床微生物标本的采集、保存、运送的要求和注意事项，对标本采集前要求病人应该做些什么准备，采集标本应选择什么时机、什么部位，每天采几次、采多少量以及采样部位应该如何消毒等一系列问题进行解释；对人体常见的正常菌群、定植菌、污染菌和感染菌等内容进行培训；对各种细菌耐药酶的检测及其含义和在选用抗生素方面的意义与临床进行经常性的沟通等等。可采用多种方法如讲座、讨论会、简讯、墙报园地甚至参与查房等形式。也可以融合到医院感染管理的继续教育培训项目之中。
4.3 参与消毒隔离的管理：正确、科学地实施消毒与隔离技术对预防和控制医院感染非常重要，正确地指导、监查消毒隔离工作也是临床微生物室的工作之一。当发生医院感染暴发流行或特殊耐药细菌感染时，临床微生物专业人员应参与制定消毒隔离措施，对相关的人员管理、废弃物的处理等环节提出微生物专业意见。
4.4 定期细菌耐药性监测结果：目前对许多感染性疾病的抗菌药物选择是经验性的。但经验用药也需要循证医学和流行病学资料的支持。建议将所有病原菌分离和药敏的资料用WHONET软件保存，定期细菌耐药性监测结果，随时统计分析ICU等重点科室常见病原菌和耐药状况，对临床经验性选择抗生素、提高重症感染的救治成功率大有帮助。
4.5 通过分子分型技术控制医院感染：常用的分子分型技术有PFGE、RAPD等。微生物实验室设置分子分型实验室，对及时发现和控制病原菌流行具有重大的意义。国外一些医院的做法是对VRE等不常见的耐药菌一经发现即进行分子分型，根据基因分型，判断流行的可能性及范围并采取相应措施控制感染［8］。如某医院对2个月时间内自16个病人分离出的19株VRE进行分型，结果显示其中十四株为一个型别，其他为一个型别，高度提示VRE流行，经调查分析，发现14名患者中11人有直接联系。根据这些分析，采取了针对控制措施而中止了感染［9］。另一些医院针对肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粘质沙雷菌等感染流行问题，均通过分子分型而得到控制。据统计，微生物室成立分子分型实验室（设备及人员）的费用为18,050美元，每年分子分型相关支出为400，000，美元，假设所有医院（美国）都常规进行分子分型，实验相关费用达20亿美元，但节省下来的治疗医院感染的费用将超过5倍（100亿）。
总之，笔者认为：临床微生物实验室在感染控制中发挥作用大小的关键：一是要走出实验室，加强与临床的联系；二是要立足本职，做好常规的临床微生物检验工作，努力提高标本的培养阳性率，缩短结果的报告时间，提高检验结果与临床治疗结果的符合率；三是要加强宣传、教育培训，在医务人员中普及临床微生物学知识，并对检验的结果作出合理的解释，协助临床正确阅读和分析微生物检验报告单，使微生物检验结果和资料能及时有效地被临床医师所利用。
微生物论文:微生物转化技术在现代医药工业中的应用
【关键词】 微生物转化技术；,,,,生物催化；,,,,关键中间体
摘要： 对微生物转化技术在现代医药工业应用上的独特优势，特别是在手性药物或药物中间体制备、借助微生物转化手段实施组合生物催化在新药筛选方面发挥的积极作用进行了阐述分析，并结合作者自身近年来在该技术领域的实践和收获对数个相关课题作了介绍。
关键词： 微生物转化技术； 生物催化； 关键中间体
1 概述
在过去的30多年中，微生物转化或酶转化技术在有机化学合成领域中的尝试不仅使理论研究获得广泛开展，在实际应用方面也取得了长足的进步。许多化学合成工艺相当复杂的药物、食品添加剂、维生素、化妆品和其它一些精细化工产品合成过程中的某些重要反应，目前已经能够用微生物或酶转化技术得以替代。在许多国外文献中经常能够看到的描述这种技术的名词有：microbial transformation、microbial conversion、biotransformation、biotransconversion和enzymation等［1，2］。微生物转化的本质是某种微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质(产物)的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，简言之，即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应(unnatural reactions)，因而微生物转化可以认为是有机化学反应中的一个特殊的分支。某种特殊的微生物能够将某种特定的底物转化成为某种特定的产物，其本质是酶的作用。因此，对酶转化无需多作解释，它与微生物转化的差别仅在于：前者是一个单一的酶催化的化学反应，而后者为了实现这一酶催化反应，需要为微生物提供一个能够生物合成这些酶的条件，因此，从这一角度来看，这似乎是真正的生物转化。另外，尽管用于生物转化的酶大多来自于微生物，但也可以是来自于动物和植物的酶。而对于一个具体的生物转化来说，究竟是采用微生物转化技术，还是采用酶转化技术，这要综合考虑实现这一过程的诸多因素，如成本、环境、技术装备和质量要求等。在研究一个微生物(或酶)转化过程时，需要仔细地考虑诸多方面的问题如：所用转化底物的选择、所用微生物对不同底物转化能力的考察、转化路线或转化反应的选择等。其中最主要的是寻找适合于所设计转化过程的微生物，以及如何来提高这种微生物的转化能力，即提高这种酶活力。再则是发现一种新的酶或一种新的反应以便为设计一个新的微生物转化过程提供一条线索。为了寻找能够适合作为生物催化剂的微生物酶，除了有必要对原来已知的一些重要的酶或反应进行重新评价外，一种更为有效的方法是筛选新的微生物菌株或酶［3～6］。用于微生物转化的菌株或酶的筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其生理生化特性的多样性(它们能够修饰和降解许许多多有机化合物)，使我们有可能找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所期望的化学反应。
2 生物转化与药物开发的应用
愈来愈多的研究表明，作为治疗用药物的外消旋体混合物有着不可避免的缺点，而美国FDA公布的手性药物指导原则无疑加快了从头开始开发单一异构体药物或利用外消旋体转换技术从已有的药物中开发单一异构体药物的步伐。手性药物制备的关键技术是不对称合成技术。多年来，有机化学工作者已经研究开发了许多种用化学的方法进行不对称合成的技术，但近20多年来，很多长期从事化学合成研究的工作者对微生物和酶反应发生了兴趣，与此同时，很多长期从事微生物和酶的研究的工作者对如何将此应用于有机合成发生了兴趣，从而使生物催化转化(biocatalytic transformation)成为一种进行不对称合成的重要技术。应用生物催化转化技术进行不对称合成与化学合成法相比较具有的优越性有：1)转化底物某一基团的专一性强，即对不需要转化的基团无需保护；2)通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率；3)生物催化转化的反应条件温和且对环境的污染很小。特别是近年来DNA重组技术的应用和新的转化系统的开发应用，使愈来愈多的原来使用化学方法进行不对称合成的化合物有可能被生物催化转化的方法来替代［7～10］。利用生物转化技术进行手性药物的开发主要进行两个方面的工作：一是进行药物关键中间体的制备，因为利用生物催化转化方法制备对映体纯化合物(enantiopure compounds)具有很大的吸引力，但试图利用这种方法来完成所期望的复杂的有机合成往往是困难的，甚至是不可能的，而利用这种方法获得某一关键中间体是切实可行的；另外，尽管用化学的方法能够在实验室条件下获得所需要的手性药物，但往往是由于成本和技术问题难以实现产业化。因此用化学生物化学的制备路线具有独特的优越性，即所谓的“绿色合成工艺”；二是进行消旋化合物的生物拆分或转化，得到单一构型的药物分子。表1为一些利用生物转化制备手性药物或关键中间体的实例［11］。
3 组合生物催化与新药发现组合
生物转化(催化)(combinatorial biocatalysis)，是指利用一种以上的具有特殊转化功能的微生物或酶，对同一个母体化合物进行组合转化，以得到化学结构的多样性，它是从已知化合物中寻找新型衍生物以及从简单化合物制备复杂化合物的有效手段。从某种角度讲，它比化学合成的方法更为简单和有效。这是一个新的研究领域。天然产物的多样性和其结构的复杂性，是存在于生物体内大量酶的作用结果。生物体内负责一系列重要生命活动的酶，在体外同样具有相同的催化能力。因此，只要体外的催化环境与体内相仿，则能够实现一系列复杂的，特别是用传统化学合成方法难以实现的化学反应。利用生物催化剂或化学合成酶催化相结合的方法，能够大大地增加衍生物的多样性，以及能够有效地对复杂天然产物的结果修饰和从简单的分子构建新的化合物库，在这过程中，往往能够发现新的生理活性物质。生物催化剂为扩大组合化学提供了各种合成的可能性［1，11～13］。表2为一些由酶或微生物催化的典型反应。利用生物催化发现先导化合物的优越性在于：1)可能进行反应的范围广；2)能够定向进行区域选择性和立体选择性；3)不需基团保护和脱保护，一步实现所需的反应；4)在温和和均一的条件下可容易地实现自动化和一步反应的重现性；5)温和的反应条件保障了复杂易变的分子结构的稳定性；6)高的催化活性可以降低催化剂的用量；7)酶的固定化可以使催化剂反复和循环使用；8)生物催化剂可在环境中被降解。
4 近年来本中心开展的一些相关课题的进展
近年来，上海来益生物药物研究开发中心开始涉及微生物转化课题的研究，特别是用微生物进行植物甾醇边链降解制备甾体药物关键中间体的开发以及抗糖尿病新药米格列醇和伏格列波糖的开发。
表1 利用生物转化制备手性药物或关键中间体的部分实例（略）
4.1 甾体类微生物转化的研究甾体药物包括激素类药物和非激素类药物：前者如性激素、类皮质激素和蛋白同化激素等；后者有抗细菌和抗肿瘤药物等。由于其不可取代的用途及治疗适应证不断扩大，甾体药物越来越引起人们的重视。利用生物转化技术进行甾体药物生产主要有植物甾醇的边链切除，以得到关键中间体ADD和4AD，以及进行立体选择性的羟化反应。(1)利用微生物转化切除边链，制备甾体药物关键中间体ADD和4AD微生物对甾体边链的裂解转化是一个很慢的过程，因为底物和产物的溶解性都很差，且底物传递至细胞的过程和产物传出细胞的过程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物转化率的重要步骤。我们在微生物转化菌株的菌种选育、转化条件的优化和转化系统的研究方面进行了数年的研究工作［14～17］，最终已经获得了具有产业化价值的微生物转化技术，即以天然维生素E生产下脚料(含有混合植物甾醇)为底物制备甾体药物关键中间体ADD和4AD的工业化路线。图1所示为混合植物甾醇底物和ADD以及4AD的化学结构。(2)利用微生物转化选择性羟基化，制备甾体药物关键中间体11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新药依普利酮关键中间体11OH坎利酮我们分别进行了以ADD、4AD以及坎利酮为底物的微生物转化菌株的筛选、选育，以及转化条件的优化等大量研究工作，最终获得了具有产业化价值的微生物转化制备工艺。图2所示为11OHADD和11OH4AD的化学结构。图3所示为从坎利酮到11OH坎利酮的微生物转化。(3)利用微生物转化技术，获得多种4AD结构类似物很多甾体药物的关键中间体与4AD的结构类似物有关，我们筛选了多种具有不同特性的微生物菌株对4AD进行转化，结果得到了一系列的4AD结构类似物，如图4所示［18］。(4)利用微生物转化技术，从植物混合甾醇直接生产睾酮在我们多年对植物甾醇微生物转化边链切除的研究过程中，发现了一个非常有意义的现象：即在经过诱变处理的大量微生物转化菌种中，发现了一株能够直接将植物甾醇转化成睾酮的菌株［19］。同时，转化条件的改变能够使睾酮的转化率大大地提高。进一步的研究表明，能够将植物甾醇直接转化成大量睾酮的微生物菌株，其17羰基还原酶的活性比较高，因而将已经转化的ADD和4AD中17位的羰基还原成为羟基，分别获得睾酮和去氢睾酮，以及另外一个17位边链发生改变的结构类似物，如图5所示。经过大量的菌种选育工作和转化条件的优化工作，已经获得了一条利用微生物转化直接从混合植物甾醇制备睾酮的工业化工艺路线。
图1 底物混合植物甾醇和产物ADD以及4AD的化学结构（略）
图2 11OHADD和11OH4AD的化学结构（略）
图3 从坎利酮到11OH坎利酮的微生物转化（略）
图4 利用微生物转化4AD得到的一系列结构类似物（略）
图5 睾酮和去氢睾酮的化学结构（略）
4.2 降糖药物米格列醇的研究开发米格列醇(miglitol)的发现源于对微生物发酵产物野尻霉素的研究，研究显示该原来作为抗沙门氏菌的抗生素具有较强的α葡萄糖苷酶抑制作用，继而成为及时个具有开发价值的淀粉酶抑制剂。1脱氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素还原而得，也可由多种链霉菌和芽孢杆菌产生，同样具有糖苷酶抑制作用。N取代1脱氧野尻霉素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的结构与葡萄糖相似，能够可逆地竞争性抑制假单糖α葡糖苷酶，减少单糖的代谢，降低在小肠的吸收。图6所示为葡萄糖、1脱氧野尻霉素和米格列醇的化学结构。根据文献报道，有多种制备米格列醇的化学合成工艺。其中有以6脱氧6氨基山梨醇为原料，经雷尼镍催化还原后，再与环氧乙烷反应而成。也可以先与环氧乙烷反应后，再在钯碳催化下还原制得。另外，也有多种利用生物转化和化学合成相结合的方法，以及先用微生物发酵制备野尻霉素或1脱氧野尻霉素后再用化学合成的方法来制备米格列醇［20］。本中心研究开发的米格列醇制备工艺采用生物转化与化学合成相结合的方法，简要工艺流程如图7所示。本制备工艺的关键是筛选具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能够实现产业化的转化工艺。
4.3 降糖药物伏格列波糖的研究开发伏格列波糖(voglibose)是新一代的α葡糖苷酶抑制剂，最初是从某种放线菌培养液中发现的氨基糖类似物，口服后能竞争拮抗性地抑制肠道内双糖类水解酶(α葡糖苷酶)，延缓糖尿病患者餐后血糖的迅速上升从而抑制餐后高血糖。同时伏格列波糖明显降低身体的脂肪量，肥胖的减轻使胰岛素受体敏感性增加，进而使空腹血糖逐渐明显下降。据文献报道，伏格列波糖的制备除了通过全化学合成获得外，还有以下几条路线：一条路线是由有效霉素产生菌发酵，从发酵液中分离出大组分有效霉素A，经生物转化后得到关键中间体valienamine和validamine，再经过化学合成即可得到终产物；或是从有效霉素发酵液中分离出小组分有效霉素G，生物转化得到关键中间体valienamine和valiolamine，两者经适当步骤的化学合成反应后即可得到终产物；第二条路线是从有效霉素发酵液中分离出小组分valienamine，经化学合成后得到终产物；第三条路线是从有效霉素发酵液中分离出小组分valiolone，同样经适当化学合成反应后得到终产物；第四条路线是由D葡萄糖经一系列的化学反应直接合成得到终产物。其流程如图8所示。本研究中心利用及时条工艺路线，筛选获得了具有高转化效率的微生物菌株，以及适合工业化生产的转化工艺。
图6 米格列醇、野尻霉素及1脱氧野尻霉素、αD葡萄糖的化学结构（略）
图7 米格列醇的制备工艺（略）
4.4 N乙酰神经氨酸的研究开发N乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒药物扎那米韦的前体，其本身也具有多种重要的应用价值。目前有三种不同的生物转化方法制备Neu5Ac(图9)：途径Ⅰ是一个相对简单的醛缩反应；途径Ⅱ涉及到反应前体ManNAc的磷酸化；途径Ⅲ所合成的产物Neu5Ac9P需要进一步用另外的酶脱磷酸化。这些合成方法均可在体外进行，目前已经用于工业化生产的是途径Ⅰ。
本中心采用途径Ⅰ的生物转化方法，首先从E.coliC600中成功地扩增了N乙酰神经氨酸裂合酶基因(nal)，通过同源性比较发现，它与来源于E.coli K12的nal序列一致。氨基酸序列比对结果表明，136和164位的氨基酸也为赖氨酸和酪氨酸，与文献报道的活性中心位点一致。进而，将该基因通过EcoRI和BamHI两个酶切位点，严格控制起始密码子和启动子间距离的情况下克隆到高表达载体pYG5上，构建成新的质粒pLY2，并进行其表达研究。然后对粗酶的制备、转化条件的优化、分析检测方法的建立，以及产物的分离纯化等进行了研究， 初步获得了一条适合工业化生产N乙酰神经氨酸的路线。
微生物论文:微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新
【关键词】 ,微生物次级代谢产物；,,生物合成基因簇；,,药物创新；,,组合生物合成；,,代谢工程
摘要： 微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。迄今为止已有超过150种生物合成基因簇通过各种方式被克隆，并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造。我们研究室已经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉素/有效霉素、多烯类抗生素FR008/克念菌素、聚醚类南昌霉素、聚酮类梅岭霉素、杂合聚酮多肽类口恶唑霉素等生物合成基因簇。深入的基因功能分析揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理，为正在进行的组合生物合成结构改造和代谢工程产量提高奠定了基础。
关键词： 微生物次级代谢产物； 生物合成基因簇； 药物创新； 组合生物合成； 代谢工程
微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)［1］和代谢工程(metabolic engineering)［2］成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。
1 微生物次级代谢产物生物合成基因簇特点及总体研究进展
1.1 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因［3］，以及随后克隆的榴菌素［4］、红霉素［5，6］、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。除此之外，微生物次级代谢产物生物合成基因簇还具有以下几个特点：①生物合成基因一般形成几个不同的转录单位；②通常含有一个以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因表达之间有一定的相互调节；③绝大多数基因表达的调控发生在转录水平，除了受特异的途径专一性调节因子调控外，还受到同时影响胞内其他产物合成甚至细胞分化的全局性调节因子的调控［7］。微生物次级代谢产物生物合成基因的成簇排列特征为相应生物合成基因的克隆提供了方便，也就是说，几乎任何一个结构基因、耐药性基因、转运蛋白基因或途径专一性调节基因的克隆都有可能导致整个生物合成基因簇的获得。
1.2 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆情况根据微生物次级代谢产物生物合成基因簇的上述特点，大量的生物合成基因簇从不同的微生物种群中克隆出来，其中主要的克隆方法有突变株回补(如放线紫红素［3］)、利用同源性较高的异源DNA作为探针的杂交法(如榴菌素［4］)、耐药性基因的克隆(如红霉素［5］)、从蛋白质分离到反推编码DNA的反向遗传(如利福霉素［8］)、根据同源蛋白保守区设计的兼并性引物扩增法(如阿卡波糖［9］)以及整个生物合成基因簇的异源表达(如肠球菌素［10］)等。通过上述克隆方法，迄今为止已经克隆了超过150种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇，一方面进一步证明了微生物次级代谢产物成簇排列的特点，另一方面也揭示了结构上不同的代谢产物在编码基因上的相关性，例如β内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)［11］负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)［1］合成。因此根据编码基因种类的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的类别来归类。
1.3 次级代谢产物生物合成基因簇资源的定向利用如此众多生物合成基因簇的克隆为微生物次级代谢产物的比较研究打下了坚实的基础。1985年Hopwood等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素［12］，标志着微生物次级代谢产物组合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程。迄今为止，组合生物合成的理论基础和技术储备已经相当丰富，并且产生了数百种非天然的“天然产物”(nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了将化学合成和酶催化进行有机结合的体外糖类随机化(in vitro glycorandomization，IVG)［13］的新概念，即把通过化学方法高效合成的多种自由糖基，在定向进化产生的具有底物识别广谱性糖基激酶、核苷转移酶和糖基转移酶的级联催化下，在体外转移到多种糖基受体，从而大量产生多种新结构、新活性衍生物的过程。他们利用万古霉素的糖基转移酶GtfE和许多非天然的NDP糖基供体一次性获得了32种携带有不同糖基的万古霉素衍生物，充分显示了该项技术的高效性和巨大潜力。微生物次级代谢产物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途径及生物合成调控机理的阐明成为可能，从而揭示生物合成途径的限速步骤和调控节点，并进行相应的遗传操作来显著提高次级代谢产物的产量或提高活性组分的比例、降低消除低活性组分的含量。因此在基因簇克隆和遗传分析基础上的代谢工程研究也变得目的性更强、效率更高。例如，Malmberg等在利用棒状链霉菌研究头霉素C的生物合成过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸向头霉素前体α氨基己二酸转化的赖氨酸ε氨基转移酶(LAT)是头霉素C生物合成的限速酶，额外拷贝LAT向棒状链霉菌的引入致使头孢霉素C的产量提高了2～5倍［14］。
2 上海交通大学分子微生物学实验室的研究进展
我们实验室长期从事重要的农业、饲养业抗生素生物合成的研究，包括抗水稻纹枯病的井冈霉素和5102I号素、抗稻瘟病的庆丰霉素、抗玉米小斑病的5102II号素和静丝霉素、 广谱抗真菌多抗霉素、 抗鸡球虫病的南昌霉素、广谱杀虫活性的梅岭霉素等。近年来我们也在抗真菌抗生素FR008/克念菌素、抗肿瘤和HIV口恶唑霉素、抗肿瘤安丝霉素的生物合成方面进行了深入研究。
表1 已克隆的微生物次级代谢产物生物合成基因簇（略）
2.1 井冈霉素/5102I的生物合成氨基糖苷类井冈霉素是由吸水链霉菌井冈变种5008产生的重要农用抗生素，是我国乃至东南亚防治水稻纹枯病的重要药物，年产量已经超过4万吨。井冈霉素和有效霉素(validamycin)的结构一致，即结合有一分子葡萄糖基的井冈胺/有效氧胺(validoxylamine)。井冈霉素的大面积使用使提高其产量(尤其是活性组分A组分的含量)，降低生产成本具有重要的意义。井冈霉素也是生产临床上重要的治疗糖尿病药物伏格列波糖(vogliobose)和阿卡波糖的重要前体，其产量的提高和特异合成中间体的积累将显著降低生产成本或简化生产工艺。井冈霉素和阿卡波糖同属于C7N氨基环醇类次级代谢产物，前期的化学喂养实验证实由7磷酸景天庚酮糖环化而成的2表5表有效醇酮是两者生物合成途径中共同的前体物，因此推断催化该步反应的环化酶基因应该有较高同源性［15］。利用来自于游动放线菌SE50/110阿卡波糖生物合成基因簇的环化酶基因acbC为异源探针，我们在井冈变种5008的基因文库中钓取了覆盖约70kb染色体区域的阳性克隆，随后该区域内30kb大片段的缺失导致突变株丧失了合成井冈霉素的能力，直接证明了该区域同井冈霉素的生物合成直接相关［16］。对acbC同源环化酶基因valA两侧45kb区域的序列测定揭示了27个开放阅读框(open reading frame,ORF)(白林泉等，待发表)，其中包括16个结构基因，2个调节基因，1个转运蛋白基因，3个与转座有关的基因，1个抗碲基因和其他4个未知基因(图1)。通过基因的逐个敲除与回补我们确定了与井冈霉素A组分合成直接相关的8个结构基因(valA, B,C,K,L,M,N,G)，而且这8个基因重新组装后在变铅青链霉菌1326中的异源表达也产生了井冈胺A和井冈霉素A。同时我们正在通过异源表达各个相关合成酶并进行相关的体外催化活性分析。一方面直接证明了环化酶ValA能够环化7磷酸景天庚酮糖生成2表5表有效醇酮，另一方面糖基转移酶ValG催化一分子的葡萄糖转移到井冈胺上从而生成最终产物井冈霉素A，而且UDP葡萄糖是的糖基供体。而对激酶ValC的体外催化分析发现井冈霉素生物合成的中间产物有效烯酮和有效酮为最适底物， 明显不同于阿卡泊糖生物合成基因簇种的同源蛋白AcbM的功能，AcbM催化2表5表有效醇酮的磷酸化(章亦荣等，待发表)。井冈霉素生物合成基因簇的克隆、序列测定和初步功能分析为其生物合成途径的最终阐明奠定了基础，同时调节基因和转运蛋白编码基因的发现也为井冈霉素产量的提高提供了最理想的改造靶点。另外初步分析显示，8个必需基因之外的其他结构基因很可能与井冈霉素其他组分的合成相关，因此这些基因功能的阐明有利于消除各种次级组分的积累、显著提高活性组分井冈霉素A的积累。最近我们在吸水链霉菌应城变种1022中克隆和测定了5102I号素的生物合成基因簇。与井冈霉素生物合成基因簇相比，5102I号素的生物合成基因簇中结构基因的排列发生了很大变化，而且也缺少相应的调节基因，这可能是5102I号素产量很低的原因(蹇晓红等，待发表)。两个相似抗生素生物合成基因簇的克隆为该类次级代谢产物的比较研究和定向改造提供了良好素材。实现井冈霉素在水稻等植物中的表达、直接抵抗水稻纹枯病等真菌病害的侵染也是本项研究的目标之一，相关工作正在开展,跨学科的合作研究也在酝酿之中。
图1 井冈霉素/有效霉素的生物合成基因簇（略）
2.2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成38元七烯大环内酯类聚酮化合物抗生素FR008是由链霉菌FR008产生的，结构上同克念菌素(candicidin)一致，具有抗真菌和杀灭蚊子幼虫的活性，临床上多用于念球菌阴道炎的治疗，还可通过降低胆固醇，减轻前列腺增生症。因为抗生素FR008结构中带有来自于对氨基苯甲酸的对氨基苯乙酮成色基团，所以我们利用来自于克念菌素产生菌灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶为异源探针，在国际上首次克隆了多烯类聚酮化合物的生物合成基因簇，即抗生素FR008的生物合成基因簇，并通过基因中断实验证实该区域跨越150kb以上［17］。最终对总共1498kb区域的序列测定揭示了21个可能的相关基因(图2)［18］，其中有6个基因编码巨大的成模块组织(modular)的聚酮合酶fscAF，共编码21个模块，这与抗生素FR008骨架合成所需的21步缩合反应是非常一致的，而且在结构域水平上揭示了七烯共轭结构形成了分子基础。基因簇序列分析还发现了与起始单位对氨基苯甲酸合成相关的基因(pabAB和pabC)、与海藻糖胺(mycosamine)糖基合成相关的基因(fscMII和fscMIII)、与糖基化和羧化等后修饰反应相关的基因(fscMI、fscP和fscO)。同时还发现了四个调节基因和两个转运蛋白，有利于提高抗生素FR008的产量。根据对抗生素FR008生物合成基因簇的生物信息学分析，我们提出了抗生素FR008复合物中四种主要组分的分子转换模式［18］，近期的研究成果表明这种推断是正确的，而且获得了只积累主要活性组分II号组分的工程菌株(周永军等，待发表)。通过对糖基转移酶基因的失活获得了一系列缺失了糖基的新衍生物，并可以初步推断出糖基的转移发生在羧化反应之后，是后修饰反应的一步。而对海藻糖胺合成相关的转氨酶基因fscMII的敲除获得了糖基上缺少氨基的一系列衍生物，显示了糖基转移酶FscMI相对的底物广谱性。
图2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成基因簇（略）
2.3 南昌霉素的生物合成酸性脂溶性聚醚抗生素南昌霉素由南昌链霉菌产生，是钠离子载体，具有很强的抗鸡球虫病活性，而且安全无毒。产量低是限制南昌霉素推广使用的主要因素，因此需要克隆其生物合成基因簇，寻找生物合成途径的限速步骤、调节基因或转运蛋白基因，通过定向的遗传改良从根本上提高其产量。由于聚醚骨架的生物合成遵循I型聚酮合酶的催化机制，因此我们利用红霉素生物合成基因簇的PKS结构域为异源探针在南昌链霉菌的基因文库中钓取了90个阳性克隆，并且经过染色体步移归为8个独立的重叠群(contig AH)，暗示该菌株可能编码至少8个聚酮生物合成基因簇［19］，这与天蓝色链霉菌［20］和除虫链霉菌［21］的基因组全序列测定揭示的链霉菌的基因组复杂性是一致的。进一步的大片段缺失实验确定了重叠群A负责南昌霉素的生物合成，在此基础上的1325kb区域的序列测定发现了30个ORF(图3)［22］， 其中与聚酮链合成相关的基因有11个(nanA1A11)，编码14个模块74个结构域，而且nanA1A6可能形成一个长达564kb的转录单位。很特别的是nan9编码的模块13中只含有酮基还原酶KR和酰基转移酶AT结构域，而缺少酰基载体蛋白ACP结构域，不过下游的nan10则编码一个独立的ACP，因此两者可能是协同作用的。在南昌霉素生物合成基因簇中并没有发现在其他聚酮生物合成基因簇中负责聚酮链释放的硫酯酶TE结构域或基因，但是初步的生物信息学分析显示在一个延伸模块(模块14)的末端有一个与酯酶同源的结构域CR，很可能通过一种不同的释放机制来释放线性的聚酮链，相关的研究正在进行之中。聚醚类次级代谢产物在聚酮链形成后要经过一系列氧化、异构等级联反应机制形成聚醚结构，在南昌霉素生物合成基因簇中异构酶NanI、环氧化酶NanO和环氧化物水解酶NanE很可能在聚酮链还没有从聚酮合成酶上释放之前催化聚醚结构的形成。另外，南昌霉素的生物合成途径还包括羟化、糖基化过程，相应的羟化酶基因nanP和糖基转移酶基因nanG5也在基因簇中找到，而且负责糖基4Omethylrhodinose生物合成的所有基因也在基因簇中存在。在南昌霉素生物合成基因簇中存在7个调节基因和2个转运蛋白编码基因，暗示南昌霉素的生物合成具有复杂的调控机制，并很可能是导致南昌霉素产量较低的主要原因。对相应调节基因功能的阐明以及在此基础上的遗传操作将会成为产量提高的突破口。另外整个基因组中8个聚酮生物合成基因簇的存在也显示了对共同前体乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的竞争，因此其他聚酮生物合成基因簇的敲除应该会导致南昌霉素的产量提高。对重叠群C的缺失的确导致了南昌霉素产量的明显提高(孙宇晖等，待发表)。
图3 南昌霉素生物合成基因簇（略）
2.4 梅岭霉素的生物合成南昌链霉菌同时产生梅岭霉素，它是一种与avermectin骨架结构相似的16元大环内酯抗生素(图4)，具有甚至比avermectin还要强的抗寄生虫活性。除了缺少齐墩果糖侧链外，梅岭霉素的主要组分还缺少C5位的甲基化，不过梅岭霉素在C4位上携带有3甲基2烯丁酸侧链。与avermectin结构和生物活性上的异同点为我们定向改造梅岭霉素或avermectin提供了切入点，如次级组分的消除、依维菌素的直接产生等等。根据avermectin生物合成基因簇的细胞色素P450羟化酶基因aveE、酮基还原酶基因aveF和硫酯酶结构域基因aveTE保守序列设计同源引物，分别在南昌链霉菌中扩增出了相应基因片段，测序后发现相互间的核酸同源性分别为706%、659%和757%。利用上述扩增片段为探针进行的杂交初步显示重叠群H负责梅岭霉素的生物合成，在该区域的大片段缺失则导致了梅岭霉素产生能力的彻底丧失［23］。最近完成的该基因簇部分区域的序列测定结构显示，梅岭霉素和avermectin在PKS区域的基因排列、模块组织形式、调节基因等有着高度的相似性，同时也揭示了两者结构差异的分子基础，为进一步的定向改造指明了方向(刘天罡等，待发表)。
2.5 其他微生物次级代谢产物生物合成基因的克隆实验室已经克隆的微生物次级代谢产物生物合成基因簇还有抗肿瘤抗生素口恶唑霉素的生物合成基因簇，它是由白色链霉菌产生的一种聚酮多肽复合物，很可能以口恶唑环作为合成的起始单位(图5)。根据结构推测，口恶唑霉素合成中的未知延伸单位(unknown extender unit)可能来自于甲氧基丙二酸单酰ACP(methoxymalonylACP)。 根据该延伸单位合成基因的保守性设计，设计兼并性引物在白色链霉菌中扩增出同源片段，进一步的基因敲除实验证实该段序列的确参与口恶唑霉素的生物合成(赵春华等，待发表)。利用该段DNA为探针也在白色链霉菌基因文库中钓到了覆盖135kb区域的阳性克隆，相关的序列测定和功能分析正在进行之中。其他正在克隆的生物合成基因簇有广谱抗真菌的多抗菌素、抗稻瘟病庆丰霉素、5102II号素等等。
图4 梅岭霉素与avermectin的结构比较及avermectin的生物合成基因簇（略）
3 小结
多种微生物次级代谢产物生物合成途径的克隆、序列测定、基因功能分析和组合生物合成探索，使我们初步构建了微生物次级代谢产物基因工程操作平台。一方面生物合成途径和调控机理的阐明为提高次级代谢产物的产量、定向提高活性组分成为可能，另一方面大量基因资源、遗传操作体系、基因操作原理、产物分离系统的积累与优化，为在研次级代谢产物的进一步结构和活性的组合生物合成改造铺平了道路。本基因操作平台的构建也形成了一个开放体系，可以为接纳并程序化其他次级代谢产物的研究与创新，并且为其他微生物次级代谢产物研究单位提供经验和支持。
微生物论文:微生物及其基因呼唤专利法保护
二十一世纪，世界生物技术的发展突飞猛进，随之也引发了一系列法律上的新问题。分析微生物及其基因是专利法意义上的发明还是科学发现？探讨其是否具备专利法保护所应具备的条件，了解发达国家加强生物技术专利保护的国际惯例，对我国的生物技术专利保护具有重要意义。
近年来，生物技术的发展取得了惊人的进步，在农业、医药、化工、环保等一系列领域引发了巨大的变革。科学家预言二十一世纪是生物技术的世纪，但是，非技术领域发展的落后使生物技术的先进性未能充分发挥。原先的政治、经济、医学、伦理道德、法律制度体系所处的制度环境因为生物技术的发展而发生了重大的改变，而原先建立起来的理论体系、操作系统却无法像生物技术的发展一样在短期内迅速实现体系的裂变、转型、升级。生物技术就像一把双刃剑，在带给人们无限惊喜的同时，也带给了人们无限的苦恼。
在法学界，生物技术及其专利性问题，一直是困扰学者们的重大难题。对于活的生物体及DNA双螺旋结构的描述主张专利权利，也引发了一系列激烈的争论，对这个问题的探讨已经涉及到了专利制度的本质以及发明和科学发现的界定、科技和伦理等一系列深层次问题。
微生物及其基因专利保护纷争
根据传统专利法的观点，要解决能否就微生物及基因主张专利权利的问题，关键在于微生物及基因应属于专利法上的发明还是科学发现。一般而言，发现是对自然现象本质规律的揭示，而发明则是这些本质规律的具体应用。科学发现虽然可能较之发明对社会的贡献更大，但其不具备专利法给予专利保护所要求的实用性，不能直接制造出前所未有的产物或直接当作某种方法使用，故不是专利法意义上的发明，不能授予专利权。也就是说，一项重要的科学发现可能会对人类产生深远的影响，可能会获得诺贝尔奖，但是却不会成为专利法上所称的发明而获得专利保护。
对微生物及基因的研究成果到底归属于发明还是科学发现的不同回答，形成了微生物及基因能否进行专利保护的两种不同观点。
一种观点我们可以称为否定说，认为微生物及基因是自然界中客观存在的，人们对其研究的成果恰如门捷列夫根据元素周期的深刻洞悉而绘出的元素周期表，或医学科研人员凭借对人体的细微研究而画出的人体解剖图，当然付出了艰苦卓绝的脑力劳动，但是仍属于科学发现的范畴，因为科学发现本身就决定了不可能是显而易见就得出结论的，因此，对于微生物及基因本身，任何人都不可主张专利权利。但是，对其进行提纯、净化、绘制的独特方法却属于专利法的保护范围，对其可以申请专利。
另一种观点我们可以称之为肯定说，认为发明人主张权利的微生物及基因已经因为发明人的提纯、净化、绘制活动而使其改变了原来自然存在的状态。由于生物科技与社会生活的紧密联系性，对微生物及基因的研究已不仅仅是对其客观规律的揭示，它与客观应用仅有一步之遥。况且，基因研究比较特殊，高风险，高投入，商业应用前景又不可估量，无论是从智慧劳动的角度还是从商业回报的角度，都应该承认其知识产权，授予专利权利，否则会使作为新兴产业的生物科技的发展受到很大影响。
笔者认为，在微生物及基因的研究成果的形成过程中，科学发现和发明两者是兼而有之的，应该对其进行区别对待。
首先，不可否认，微生物及基因是客观存在于自然界中的，这并不以我们对其认识多少为转移，首次观察到他们的存在应该是一种对客观事物的揭示，是一种科学发现，当然这种发现也不具有专利法保护所要求的工业实用性标准。所以，即使科研人员为此耗费了毕生的精力，也不能因此主张专利权利，这就像科研人员观察、测算到了某个宇宙天体的客观存在但却不能主张专利权利收取专利费用一样。
其次，如果研究进一步深入，科研人员对微生物及基因进行一系列的分离、提纯、净化，改变它在自然界天然的存在方式和状态，使其能为人力所控制，并发掘出它为社会所利用的价值，那么我们就没有理由拒绝为其提供专利法上的保护了。
其实，科学发现和发明在科技研究中是紧密结合的。任何一项科技发明活动，都必须以原来的科学发现为基础，没有任何一项发明是凭空产生的，只有熟练掌握该领域的客观事物和规律，才能谈得上发明创新。在生物技术的科研领域中当然也是这样，只不过由于生物技术研发本身所具有的高度专业性和连续性，微生物及基因的首次发现者和深层研发利用者往往是同一研究主体。这种发展现状使得发明和科学发现连为一体，互相交织，相互作用，真假难辨。简单地讲，没有对客观规律的揭示或微生物、基因的首次发现，就不可能有生物技术的相关发明，但是，仅仅是客观揭示和首次发现而请求专利法的保护又是不够的。这其中，科研人员要做的是将两者结合起来，搞出生物科技发明成果。我们要做的是将两者分离开来，予以不同的法律态度。
我国生物技术专利法保护的现状及对策
我国生物技术的专利保护起步晚于国外发达国家，在现行的专利法中没有生物技术专利保护的法律规定。但在专利法实施细则中，有关于生物材料的样品提交以及分类保藏的具体要求。审查指南中，也有对如何确定一类微生物是否具备专利保护条件的判断标准：“未经人类的任何技术处理而存在于自然界的微生物由于属于科学发现，且不具有工业实用性，所以不授予专利权。只有当微生物经过分离成为纯培养物，并且具有特定的工业用途时，微生物本身才是授予专利的主体”。
应该说，我国关于生物技术专利保护的立法是和TRIPS的相关保护思想相一致的，对工作人员在实际操作中是否给予某项生物技术以专利保护提供了法律依据，对于发展我国的生物技术具有积极的现实意义。
我们不难发现，在我国生物技术的法律保护中，再去争论微生物及基因在发明、科学发现中的归属以及是否给予其专利保护的问题已经没有太大意义。发达国家的生物技术在宽松的法律环境和强大的政府支持下得以迅速发展，作为生物技术发源地的美国，目前已拥有全世界三分之二强的生物技术公司，其中光是大的生物制药公司就有225家，工业投资350亿美元，可以说对生物技术宽松的法律支持已经在为而且会继续为美国创造巨大的财富。随着发展中国家和发达国家在生物技术上的差距日益加大，运用生物技术的断优势掠夺全球有限的生物技术资源的“生物海盗行为”会越来越多。在发达国家抢滩登陆建立生物技术上的专利壁垒以取代被逐渐拆除的关税壁垒的时候，发展中国家所能做的不是沉浸于到底要不要保护的学理争论之中，而是从维护本国利益出发，在科研实力、法律保护上奋起直追，跟上国际知识产权保护的步伐，真正地学会用知识产权的武器维护自己的正当利益，免受他国的“恶意侵害”。无论是从公共健康、商业利益出发，还是从科技进步、社会发展考虑，生物技术的专利保护都势在必行。
当前，较大限度地利用现有优势，加快生物技术专利的国际保护进程，在专利的国际申请中，充分利用国际条约中的外国优先权制度，争取以最快的时间在国际上抢占先机已是当务之急。
1967年修订的保护工业产权巴黎公约规定：“已在一个本同盟成员国正式提出过一项发明专利、一项实用新型、一项工业品式样或一项注册商标的申请人或其他权利继承人，在下列规定的期限内在其他本同盟成员国提出同样的申请时享有优先权。”上述优先权期限，对于发明专利和实用新型，规定为12个月，对工业品式样和商标规定为6个月。简单地讲，就微生物及基因的专利保护而言，在12个月以内，专利申请人在巴黎公约其他缔约国提出的专利申请以他在本国首次提出的专利申请日期作为判断新颖性的时间标准。这种优先权利的取得要以申请人在本国规定的最迟期限内作出声明作为形式要件。
12个月的时间对于人类社会的发展来说只是短短的一瞬，但是对于发展速度突飞猛进的生物技术来讲可能意味着天翻地覆的变化。生物技术的发展正在体现出“强者愈强，弱者愈弱”的态势。我国如果不能抢得先机，就会受到各种不公平的待遇，发展的成本就会成倍地增长。
