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分析激光技术的应用:分析激光技术在医学上的应
摘要 主要介绍了激光全息技术和C02医用激光的兴起和在医学领域的应用,从激光全息技术的原理到原先再现,都作了详细的说明。对C02医用激光器在实际工作中的具体应用和改进作了详细介绍。
关键词 全息技术;全息照相术;全息再现;C02医用激光器
1 激光全患技术
激光全息技术是20世纪60年代初兴起的一门技术。激光全息技术发展很快,已在生产和科研的许多领域中广泛应用。把激光全息技术应用于医学的是Van Ugten,他于1966年在世界上首次摄得眼全息图,但限于当时的技术水平,再现像的分辨率较差。以后各国科学家相继开始将激光全息技术应用于医学领域,从眼科扩展至胸外科、口腔科等。二次曝光的成功,促成了全息测量技术的发展,20世纪70年代出现的超声全息技术,将全息技术推进了一大步。由于超声可深入人体内部,因而超声全息可探测人体内部器官,如肠、胃、肝、胆及主胎儿等的生理异常,肢端和关节软组织的超声全息成像是极有价值的,超声全息还有希望应用于腱、肌肉和神经结构的显示。激光全息医学诊断术虽然产生的时间不长,但由于它具有种种优点,已越来越为人们所重视,并日益广泛地应用于临床。
1.1 全患照相术
全息照相术与一般照相不同,照相是记录物体信息的一种技术,一般是将物体通过透镜成像在底片上,底片乳胶只记录光强(振幅),而不能记录相位,因而失掉了三维特征。而全息照相底片上不只记录光强(振幅),也记录相位(各点间的相互位相关系),也就是记录物的全部信息,所以称为全息。
全息照片最早是由英国汤姆逊-豪斯敦公司的:盖宝摄得。照片的实质是将来自物体的波前和另一个参考波(通常是平面波或球面波)相干涉,底片记录干涉条纹,将同样的参考波照射此底片时,可在相应位置重新出现三维物体。
由此可见,全息照相和一般照相具有相同之处,即同样是记录物体信息的一种手段,但又有所不同,其特点如下:
(1)因为全息照相记录的是物体的光波,而不是物体的像,因而用这种底片来观察物体时,可以变换视点来改变观察方向,亦即可以从不同的位置来考察物体(而一般照相只是从照相位置观察物体,即在照相镜头处观察物体)。观察方向只受到照片尺寸大小的限制。
(2)全息照相不需要透镜,但需要一个参考波源,如果参考波和再现波采用不同的波长,那么还可以具有放大或缩小的功能。
(3)全息照相具有深度效应(体视效应)。如变换观察方向时,后面部分可被前面部分遮挡,远处物体随着观察者运动而近处的不动,闪光忽隐忽现等。
(4)普通照相底片能直接看出物体的形状,而全息照相由于在激光照射下,记录的是干涉图样,所以在普通光线下观察时,看不到什么物体,而只是灰色的一片,要想见到展现物,必须用再现光照射(目前已制出一种能在普通光照射下再现的全息照片)。
(5)全息片记录的是干涉条纹,对底片的分辨率要求较高(在参考光和物体之间夹角很小时,可采用分辨率略低些的底片)。因此,稍有振动,就会使照片模糊,故必须采取严格的防震措施。
(6)普通相正负片的结果正好相反,而在全息照片中,不论正片还是负片结果一样。
1.2 全息技术在医学上的应用
眼全息照相实验装置简图。激光由半反镜分成两束,一束为球面波参考光,另一束通过纤维光束,以球状通过接触镜进入眼球,眼球各部分的反射光和慢射光由瞳孔中央部6mm直径处射出,经投影透镜作为物波记录在全息底版上,激光是氩离子激光器,λ= 0.5145Um P=100mW t=10ms-30ms,眼底网膜上的光亮约为3×10-3J/cm2。重现象可观察晶体表面、虹膜和视网膜。这样就能用一张全息照片对从晶体到网膜的眼球各部分自由地进行三维检测。
为使全息像地再现,必须在再现时地重复参考光。冲洗好的全息片必须放好,误差一般应小于几秒弧度,以免发生慧差和相差,再现装置的示意图,激光经准直器照亮全息图片,通过显微镜或闭路电视系统观察实像。全息图片夹在可以多维微量调整的
定位器上,以作精密定位,调整时在显微镜下或电视屏幕上观察,使失真和像差最小,而成像清晰。
利用全息可以拍到活体眼的角膜、晶状体和视网膜相片,从而对眼的各层介质进行活体观察,这是用其它方法难以办到的眼全息图,亦可表示出眼内的异物的大小、形状和位置。
此外,利用激光全息二次曝光法,可对人体各部分进行三维记录。而根据再现图上的干涉条纹又可以测量人体器官的变形、内力和振动等。用全息测量矫形手术,前后股骨的髌骨端的变形,以使人工髋关节的形状达到程度,还可利用二次曝光法分析人体胸廓的变形,以寻找癌变部位和大小,也可对眼底的微循环进行研究,利用超声全息技术,可以获得一般照相技术无法得到的体内器官全息像。由于超声的无损性,因而这一方法被认为是探测人体内脏器官和胎儿的方法。
2 C02医用激光器在医学上的应用及改进
2.1 C02医用激光器在医学上的应用
随着激光技术的迅猛发展,激光在医学上的应用越来越广泛,激光可作为良好的手术刀用,它不但运用于一切手术开刀,而且具有良好的选择性,与常规手术刀相比,激光手术的较大特点是失血少,对于某些部位和器官用激光作手术最有优越性。我院购置的C02医用激光器是上海医用激光仪器厂研制并生产的YYJG-lA型,该机性能,使用方便,随机备有烧灼探头,聚焦镜头和散焦镜头,不仅能使激光能输出原光束外,还能输出聚焦光束和散焦光束,它们分别进行烧灼、烧割和局部照射等治疗,有效地应用于皮肤科、妇产科、外科、肛肠科、五官科的治疗,治疗效果非常显着。
YYJG-lA C02医用激光器是以C02气体为工作物质的分子气体激光器,主要应用C02分子的振动--转动能级间的粒子数反转后受激辐射产生激光,本机激励泵浦源采用直流高压电源。从电场获得高能量的电子较易把辅助气体的N2分子激发到某一高能态,再与C02分子碰撞,发生能量的共振转移,把C02分子激发到某一亚稳态的高能级,形成对某一低能级的粒子数反转。亚稳态高能级的C02分子再受激跃迁到该低能级,释放10.6um波长的光子,经光学谐振腔的光振荡光放大后形成C02激光。10.6um波长的C02激光属红外波段,热效应很强,为避免激光管谐振腔两端反射镜片及放电管湿度过高,引起反射镜片及放电管损坏,激光管必须设置水冷系统。
由于C02激光器激励直流电源电压较高,电流较大,而激光管本身比较娇嫩,本机除设有断水保护装置外,还设有过电压、过电流保护装置。如因各种异常原因,产生工作电压、工作电流超过额定值或循环水冷系统断水时,保护装置立即动作,切断总电源。
2.2 C02激光器在医学上的广泛应用
皮肤科主要应用于尖锐湿疣、扁平疣等的烧割。
外科主要应用:(1)具有止血功能的手术;(2)与内窥镜结合,在腔内进行手术;(3)采用光敏技术,对肿瘤进行治疗;(4)对组织进行焊接;(5)理疗与康复治疗。
肛肠科主要应用于内外痔、肛裂、肛瘘、息肉及肛周外生殖器尖锐湿疣手术。
在内窥镜下,用激光可治疗的有食管疾病、胃肠疾病,如食管静脉曲张、食管癌、肺癌、胃息肉、十二指肠溃疡、胃出血、喷门癌、十二指肠癌、胆管癌、胆管结石、胆道狭窄、结肠癌。
妇产科应用于宫颈糜烂、外阴瘙痒、外阴炎及妇科的各种炎症等。眼科应用于眼部肿瘤的切除、巩膜切开及球壁再造术。它还可直接气化肿瘤。五官科主要应用于鼻炎及咽炎等。
以上C02激光的应用的共同特点是不需要全身麻醉,并发症少,快速简便和失血少,易被水吸收,因此穿透力较低,被照射部位升温很快,对周围组织损伤较小,适用于切割与气体化组织。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的杀菌作用。
2.3 YYJG-1A激光器的改进
目前的C02激光器共同的缺点就是在手术中产生有毒有害气体,不仅使手术视野模糊,而且危害医务人员和患者的健康。有些病人的病变组织在激光气化过程中产生不少带有病毒的激光烟尘,病毒随着激光烟尘的逸 散传染给医务人员。虽然利用吸烟机把有毒气体吸走,但需要一名特别助手,而且麻烦。在妇科烧灼宫颈糜烂时,其缺点尤为突出,阴道内产生的高热烟尘,不仅影响医生的操作视线,而且还会造成金属窥阴器发烫,继而造成阴道壁烫伤,故必须加接吸烟尘装置。
2.3.1 加接吸烟尘装置方法
做一个扁形金属小吸管,与烧灼探头(或聚焦镜头)并排紧固,金属小吸管再接上皮管通到室外与吸尘器连接,这样就能很好地将烟尘吸出到室外。
2.3.2 加接扩照用单开关
该机除有烧灼、烧割用途外,尚有发散扩照功能,仅靠一只脚开关控制出光,在烧灼或烧割治疗时,宜用脚开关控制输出,但如用于治疗时(照射时间一般为连续15min左右)靠医务人员踩脚踏开关控制出光就不甚合适。
改进方法:在脚踏开关两端关联一只单开关。在扩照治疗时,只须将单开关开启即可,免去了医务人员脚踩之劳。但此时特别要注意,在烧灼烧割治疗时,单开关应严格处于关的位置,绝不允许随意拨动它,否则会造成激光伤人的危险。
此外,还可以装置简易水电极,以免玻璃水电极坏后更换不及时,并提高C02激光器的使用寿命。
分析激光技术的应用:原子干涉激光技术锁定
1引言
原子干涉仪可以地测量重力加速度和重力梯度[l,2]、牛顿引力常数[:‘一创、地球自转速率和旋转速率卜8一以及精细结构常数[0l,在导航、资源勘探、地震监测、大地测量及环境监控等方面具有重要应用前景〔“〕,川。原子干涉仪通常采取三对拉曼光脉冲序列(洲2一7T一对2)对原子波包进行相干操作〔‘2],高功率的拉曼光可让更多的原子参与速度敏感型受激拉曼跃迁,有利于实现信噪比高的原子干涉仪条纹。研制高功率的拉曼激光器对冷原子干涉仪的实验研究具有重要意义。注入锁定技术是提高激光功率同时保持注入光相下胜的有效方法[l“]。半导体激光器注入锁定时,需将主激光器的输出光注入到从激光器中,主激光器一般选用窄线宽、单纵模的激光器,从激光器选取功率较大的半导体激光器,当主、从激光器的频率、偏振匹配时,从激光器可被注入锁定,此时从激光器的频率、相位和偏振与主激光器同步,主激光器的输出功率被从激光器有效地放大。注入锁定技术的实验研究已有大量报道,最早实现注入锁定的是氦氖激光器[l4],后来注入锁定被应用于二氧化碳激光器115,‘“]。近年来,半导体激光器的应用范围越来越广,其注入锁定技术也有了很大的发展!‘7]。2000年北京大学王晓辉等利用半导体激光器速率方程的两模式场模型描述了从激光器的注入锁定理论[l”],2008年实现了垂直腔面发射半导体激光器的注入锁定[‘”]。经过高频声光调制器移频后的两个激光场能保持很好的相干性,并避免了注入锁定过程中的模式竞争,频率和相位相对稳定,可作为拉曼光用于原子干涉仪。高频声光调制器的衍射效率往往较低,调制产生的拉曼光不能满足原子干涉仪对激光功率的需求。如前所述,注入锁定技术可实现激光功率的放大,因此将声光调制技术与注入锁定技术结合起来是实现高功率拉曼光的新思路。
我们基于声光调制与注入锁定技术,开展了用于冷原子干涉仪的拉曼光注入锁定的实验研究,实现了高功率的拉曼光。主激光器经过1.5GHz高频声光晶体移频后得到功率分别3mw和4mw的士1级光,分别注入两个输出功率为80mw的半导体激光管,实现了两个从激光器的注入锁定。两个从激光器的频差为3.0GHz,在200MHz频率范围内频差线性变化,功率稳定,满足冷原子干涉仪的实验要求。
2实验装置实验原理如图1所示,主激光器用外腔反馈半导体激光器(ToPtica,DLllo),激光波长为780mn,输出功率为36mw,主激光通过一个直径为50mm的大透镜聚焦到1.5GHz的高频声光调制器(BI.ilnrose,GPF一1500一200一780),经过往返两次调制后的衍射效率可以达到20%。主激光通过声光移频后得到士1级衍射光,将70%透过的零级光用全反镜反射后原路返回,重新通过声光移频得到一1级衍射光。微波源(Agilent,E8257C一PSG)驱动声光调制器,驱动频率为1.5GHz,因此,士1级衍射光的频率差为3.0GHz。我们将士1级衍射光(注入光)分别注入两台从激光器,从激光器采用自制的半导体激光器,用自主研发的电流控制电路和温度控制电路控制半导体激光管[z0],用非球面镜(ThorlabS,c230TME一B)对激光管(ThorlabS,DL741o一205)输出的激光束进行准直。在注入锁定过程中,先把注入光与从激光器的输出光调重合,用波长计观测从激光器的波长,通过调节从激光器的驱动电流和温度控制,使从激光器的输出波长在780nm附近,用三角波扫描主激光器,同时观察主激光器和从激光器的吸收谱线,通过微调从激光器的电流,将从激光器调节到模式,实现两个从激光器和两个注入光的激光模式匹配,此时,两个从激光器的频率依赖于主激光器,功率为从激光器自身输出功率,实现了拉曼光激光功率的有效放大。完成注入锁定后,将两个从激光器输出的激光通过偏振分束棱镜藕合到保偏光纤,送到原子干涉区。拉曼光的相对光强可以通过入/2波片调节,以消除acStark频移睁‘]。在冷原子干涉实验过程中,采用偏振光谱稳频技术,将主激光器锁定在”SRb原子的护S!/ZF=3一52P华Fl二2,3的交叉峰上。
3实验结果当从激光器被注入锁定后,利用三角波对主激光器进行外腔扫描,可以得到Rb原子的吸收谱线,两台从激光器被主激光器经过 1.5GHz声光调制器移频后的士1级光分别注入锁定,主激光器 (masterlaser箭头标示位置)和士1级光被注入锁定后的两个从激光器 (slaverlaserl和 slaverlaserZ箭头标示位置)的吸收谱线如图2所示,可以看出,主激光器与从激光器被注入锁定后的吸收谱线(ssRb原子5251/2,F=3一5“P3/2,F’跃迁)的形状一致,两台从激光器被主激光器经过1.5GHz声光调制器移频后分别注入锁定,从激光器相对于主激光器的频率分别左、右失谐1.5GHz,由此可以看出两个从激光器被注入锁定。两个从激光器的频率依赖于主激光器,频率相差3.0GHz,为““Rb原子超精细结构基态能级的微波跃迁频率,相位保持相对稳定,同时两个从激光器相对“SRb原子的DZ线负失谐1.5GHz,实现了大失谐的拉曼光激光系统,可以实现原子干涉仪中波包的相干操作。我们将两个从激光器的输出激光进行拍频,用25GHz快速响应光电二极管(New-foclls1434一25G)进行探测,用频谱仪观察到的拍频信号如图3所示,在3.035GHz附近的拍频峰半高宽约为17kHz,信噪比优于55dB. 在主激光器的功率为39.0mw的情况下,拉曼光经过光纤藕合后总的输出功率为4(i8mw,其中+1级光输出功率为36.0mw,一1级光为10.8mw,两束拉曼光的光强比例为1:3.5[al}。用微波源对拍频信号进行扫描,拍频信号的频率随着微波源的扫描频率线性变化,如图4所示,实心圆点曲线为拍频信号中心频率变化,中空方块曲线为拍频信号的功率随着微波源扫描频率的变化关系,可以看出在200MHz的频率扫描范围内,拍频信号的功率保持相对稳定。由于主激光器被正负移频后注入从激光器,因此拉曼光拍频信号的频率是微波源扫描频率的两倍,通过拍频信号的强度可以判断从激光器是否被锁定。我们用频谱分析仪实时监测拍频信号的频率和功率,两个从激光器被注入锁定长达几十个小时。
4结论我们利用注入锁定技术实现了拉曼光的功率放大,克服了用高频声光调制器产生的拉曼光功率较低的问题,在原子干涉仪实验中,使更多的原子参与到波包相干操作过程中,提高了冷原子干涉仪的条纹对比度,为冷原子干涉仪在精密测量领域中的应用奠定了技术基础。
分析激光技术的应用:腔内钬激光技术在输尿管结石合并息肉致输尿管梗阻中的应用
作者：周开华，石否，刘东亮，朱蜀侠，吕健为
【关键词】 输尿管结石
【摘要】 目的 评价腔内钬激光技术治疗输尿管结石合并息肉致输尿管梗阻的疗效。方法 自2003年12月始，在腔镜下应用钬激光技术治疗因结石合并息肉致输尿管梗阻47例。结果 47例患者中，44例(94％)一次手术成功，另外3例患者中，2例因术中切割息肉过程中结石上移至肾盂，于输尿管通畅后置双J管，1周后行体外冲击波碎石（ESWL），效果较好；1例因输尿管迂曲成角，上镜困难，术中改行输尿管梗阻段（含结石）切除并吻合术。手术平均时间45min(30～90min)，平均住院日6天(5～9天)。47例患者术后3～6个月复查IVP,输尿管通畅。结论 应用钬激光经输尿管镜治疗输尿管结石合并息肉致输尿管梗阻是一种安全、有效的微创治疗方法，具有避免开放手术、手术时间短、恢复快、创伤小、住院时间短等优点。
【关键词】 钬激光；输尿管结石；输尿管梗阻
近年来，钬激光技术在泌尿外科领域的广泛应用，促进了微创外科以及腔内泌尿外科的发展［1］。我院自2003年12月始，在腔镜下应用钬激光技术治疗因结石合并息肉致输尿管梗阻47例，均获满意效果。报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组47例患者，男20例，女27例；年龄25～78岁，平均40.3岁。病程1个月～10年，平均10个月。同侧肾脏合并结石22例，男8例，女14例。双侧肾脏合并结石15例，男6例，女9例。其中中上段结石30例，下段结石17例。15例曾行体外冲击波碎石（ESWL）治疗。结石最小0.6cm×0.8cm,较大1.8cm×3.0cm,平均0.8cm×1.4cm。术前常规B超检查示肾脏重度积水，结石以上输尿管扩张；静脉肾盂造影示肾脏不显影或重度积水，结石以上输尿管扩张，结石以下不显影；输尿管逆行插管及造影剂均不能到达结石，中间有充盈缺损，长度为0.5～1.0cm,诊断为输尿管结石，输尿管梗阻。
1.2 治疗方法 全部病例均在持续硬脊膜外腔麻醉下手术。术前清晨复查KUB确定结石位置有无变化。采用Wolf F8/9.8输尿管硬镜，MMC液压泵，WOLF摄像系统，德国Dormier公司的15W钬激光系统。麻醉采用高、低两个不同部位的硬膜外腔麻醉方法，患者取膀胱截石位，常规消毒铺巾，经尿道直视下插入输尿管镜，找到输尿管开口后，先插入一根Fr3的输尿管导管，利用液压灌注泵压力扩开输尿管口，同时将镜体沿轴线旋转90°～180°入镜，进入输尿管口后镜体回复中立位，并调小灌注速度，沿输尿管导管上行。入镜至梗阻段输尿管部位后，置入钬激光光纤，输出能量设为1.5J×10Hz,烧灼或切割息肉及增生组织，显露结石后再行碎石治疗。碎石后再次烧灼或切割息肉，使输尿管镜通过顺利。术后常规放置7或8Fr的双J管4～8周。
2 结果
47例患者中，44例(94％)一次手术成功，另外3例患者中，2例因术中切割息肉过程中结石上移至肾盂，于输尿管通畅后置双J管，1周后行ESWL，效果较好；1例因输尿管迂曲成角，上镜困难，术中改行输尿管梗阻段（含结石）切除并吻合术。手术平均时间45min(30～90min)，平均住院日6天(5～9天)。47例患者术后3～6个月复查IVP,输尿管均通畅。
3 讨论
尿路结石是泌尿外科的常见疾病，传统的开放手术治疗尿路结石已逐渐被腔内泌尿外科技术所取代，包括ESWL、气压弹道经输尿管镜碎石排石术、经皮肾造瘘取石术(PCNL)，甚至可使用腹腔镜输尿管切开取石术。但被炎性息肉包绕的结石引起输尿管梗阻为上述腔内碎石手术禁忌，多通过开放手术处理。钬激光技术在泌尿外科中的应用，使其通过腔内治疗成为突破。钬激光是一种高能脉冲式固体激光，其波长为2140nm，脉冲时间为0.25ms，远远小于组织的热传导时间(1ms)，故对周围组织热损伤极小，当钬激光照射组织时，可以瞬间达到高温，引起被照射组织局部迅速汽化切割和凝结，对生物组织的穿透度很浅，仅为0.44mm，组织切除发生在表面，热损伤区域为0.5～1.0mm范围内，止血效果好，使得钬激光成为的泌尿软组织切除理想工具。同时钬激光具有非常的碎石能力，碎石过程中，结石表面的水和结石中的水吸收了钬激光的能量后汽化形成小球，汽化小球随后裂解所形成的冲击波产生二次压力，使结石粉碎，这样就可以高效粉碎各种成分的泌尿系结石［2］。
对输尿管结石伴明显息肉包裹而管腔阻塞者，术前检查中应明确输尿管结石合并息肉致输尿管梗阻的长度和远近端的方向。对于梗阻段<1cm者，我们选用腔内钬激光技术治疗，始终在输尿管镜直视下操作。首先用钬激光沿梗阻段输尿管方向在输尿管中心切割息肉和组织，边切割边寻找正常通道，切割时要保持视野清晰，避免可能形成假道或致输尿管穿孔，发现结石后行碎石治疗，这样首先明确正确的通道方向，然后再切割及消融输尿管内多余组织及息肉，使输尿管镜顺利通过。在导丝引导下置入双J管一根，保留4～8周。患者一般5～7天出院。对于输尿管上段结石在碎石时还应注意降低或者关闭冲水，并调整患者体位为头高脚低位，可以减小结石移位肾脏的可能性，对于输尿管上段结石术中移位肾脏者，可经ESWL治疗后排除结石［3］。
通过本组病例治疗实践，笔者体会：（1）应用钬激光经输尿管镜治疗输尿管结石合并息肉致输尿管梗阻是一种安全、有效的微创治疗方法，具有一次性碎石率高、手术时间短、恢复快、住院时间短等优点［4］。（2）应用钬激光经输尿管镜治疗输尿管结石合并息肉致输尿管梗阻，由于其组织穿透度＜0.5mm,在内镜下可治疗，视野清晰，出血少，安全无严重并发症。（3）钬激光为脉冲式激光，瞬间峰值功率高达10kW,具有极佳的切割、汽化和碎石功能，能有效地切除息肉或瘢痕后，再行碎石治疗，效果较好。（4）钬激光治疗输尿管结石疗效好，90％以上的患者可经钬激光成功粉碎结石及其他治疗。但碎石成功与否的最终决定因素并不是激光本身，而是其他因素：如结石大小和位置、是否因解剖变异或输尿管狭窄而存在结石通过困难等［1］。本组病例中未成功3例，均为上述因素引起。随着腔内泌尿外科技术及钬激光技术本身的不断改进，相信钬激光在泌尿外科领域将会得到更多、更广泛的应用［5］。
分析激光技术的应用:应用激光捕获显微切割技术制备肺癌蛋白质组学研究样品
作者：田应选 南岩东 杨拴盈
【摘要】
目的 探讨应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性。方法 将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8μm冰冻切片，采用改良的HE方法染色；应用LCM技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞；选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞。结果 通过LCM技术可以、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织，得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞。按照Duration 15.5s的激光脉冲频率和平均8000 shots条件，既可保障每个帽子的细胞收集数量，也能够有效地缩短实验时间，提高实验可控性，从而使操作过程标准化。结论 应用LCM技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞。其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好，是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法。
【关键词】 激光捕获显微切割；肺癌组织；蛋白质组学
蛋白质组学是当今肿瘤学研究领域中的一个热点，而“差异”蛋白质组学又是蛋白质组学研究的一个突破口。在有关“差异”的研究中，若原始样品不是分别来自同一类型，或样品存在着杂质蛋白的污染，那么所得实验数据的性和说服力必然会受到影响[1]。众所周知，人体组织器官是多种细胞的复合，肿瘤组织的不均一性是肿瘤细胞的重要特征。因此，如何从复杂、不均一的样品中获得理想的高同质性的组分成为实验中亟需解决的主要问题之一。激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)技术的出现为上述问题提供很好的解决方案。该方法的突出特点是能在目视下从样品中特异挑选同类细胞乃至单一细胞；从而剔除间质细胞和坏死组织及其他可能影响结果分析的杂质成分[2]。本研究应用LCM针对不同类型组织标本，选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞，以期探讨该方法在肺癌研究中的技术参数和操作流程。
1 材料与方法
1.1 标本的收集及制备 收集西安交通大学医学院第二附属医院胸外科、陕西省人民医院胸心外科及陕西省肿瘤医院胸外科2005-2006年经病理诊断证实的手术切除肿瘤标本12例，其中肺鳞癌6例，肺腺癌6例。正常对照组织为同一患者正常肺组织。12例患者中男性8例，女性4例；有吸烟史者5人，平均吸烟指数1900支/年；肿瘤分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期7例(Ⅱ A3例，Ⅱ B4例)、Ⅲ期3例。所有病例标本均在手术室采集，具体操作如下：待组织标本离体后立即切取肿瘤组织，同时切取正常对照组织；4℃冰盐水冲洗3-5次，将血液冲净，均匀分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm组织块，分装于标志清楚的0.5mL离心管中；先置液氮中速冻，后置于-80℃冰箱保存备用。整个标本采集过程耗时控制于30min内。
1.2 试剂和仪器 苏木精、伊红、无水乙醇、二甲苯、尿素等均为国产分析纯。组织包埋剂(OTC)，冰冻切片机(Microm，HM500)，超低温冰箱(Thermo Forma -86℃)，Pixcell显微激光切割系统(Arcturus, USA)及乙烯乙酸乙烯酯膜帽子细胞收集器(EVA LCM Caps)。
1.3 方法
1.3.1 冰冻切片的制备及染色 预处理载玻片(将普通载玻片清洗干净，流水冲洗后泡酸过夜，双蒸水冲洗干净，60℃烘干备用)。取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小组织两块，OTC包埋，待组织包埋固定，将切片机箱内温度设置为-25℃进行切片，切片厚度8μm，每次连续制作15张切片，-80℃保存备用。两组肿瘤组织和对照各6例，每例患者制作切片15张，进行HE染色，方法如下：苏木精10s，捞片置于冰水冲洗10s，伊红15s，85%、95%(体积分数)乙醇各20s，无水乙醇2min，2次，二甲苯Ⅰ 2min，二甲苯Ⅱ 2min。上述染色过程在冰盒中进行，染液温度控制于4-10℃，总时间控制在10min以内。完毕后进行激光捕获。
1.3.2 激光捕获 将染色完好切片置于Pixcell显微激光切割系统10×10倍目镜直视观察，重点观察细胞形态和染色情况。找到细胞密集、形态较好、染色满意区域，装载细胞收集器；在10×20倍目镜下调节监视器，按照如下条件：Power 100mV、Duration 15.5s、Spots size 15.5μm、Current 8.0mA，每张切片平均8000 shots条件进行捕获。总捕获时间不超过40min。
2 结果
切片按照改良的HE方法染色后，均能获得细胞形态完整、对比度好、肿瘤细胞和间质可清楚区分的合格切片。在设定捕获条件下，每张切片捕获后能够将90%以上的细胞收集，细胞同质性高(图1)。按照理论测算，每个shots可以捕获4-6个细胞，即每个帽子收集装置可以获得25000-30000个细胞数。总体捕获结果见表1。
3 讨论
肺脏是一个开放器官，容易受到外界污染，加之肺癌组织含有较多间质细胞而且容易坏死，因此，按照传统方法进行组织块研磨提取总蛋白进行分析，结果难免会受到杂质蛋白的影响。LCM技术现已成为蛋白质组学研究中获得纯化的目的细胞的理想工具，其在实体瘤研究中应用较多，技术方法亦日臻成熟[3?5]。但据文献报道，该方法主要用于核酸分子以及染色体研究，在肺癌组织蛋白组学研究领域鲜见[6]。本研究应用LCM技术切割不同类型肺癌组织，获得250个帽子收集装置和8.7×106个细胞数。从捕获操作过程中我们发现，捕获细胞的同质性、细胞收集率以及操作过程所耗费时间是影响激光捕获及后续蛋白质组学实验结果的关键因素。由于LCM是在直视下操作，细胞纯度可以保障。经随机抽取3组、45个帽子收集装置，使用Pixcell II显微激光切割系统内标记尺划分观察视野，抽样估算收集装置内细胞同质性可达到95%以上，该结果与文献报道一致[7]。当然，文献报道最多的是关于基因和分子水平的研究，但其中的切片制作和LCM切割部分是相同的。Pixcell II显微激光切割系统是新一代系统，该系统的优点是使用的是乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(ethylene vinyl acetate caps, EVA caps)细胞收集装置，可避免操作者手接触所收集到的细胞，减少污染机会。EVA膜需要和细胞紧密接触才能够被激光束融化而将目标细胞收集，因而LCM过程受很多因素影响而不能保障将每个捕获细胞均能收集。激光捕获仪主要参数有：Power、Duration、Spot size、Repeat及Current等。一般在打开系统进行切割之前，应先在帽子空白区空打5-6次，观察激光能量，光点大小是否合适，以光点能够覆盖目标细胞为宜。本实验中所选择条件是：Power 100mW、Duration 15.5ms、Spot size 7.5-15μm、Repeat 0.2s、Current 8.0mA。Zhukov等[8]应用LCM切割肺癌组织时认为，鳞癌可选择7.5μm激光束，腺癌中用15μm，可获得较好效果。在本实验中，我们发现激光束的大小与鳞癌和腺癌组织类型关系不明显，但与切片的制作和捕获操作过程关系较大，切片的厚度、脱水时间和EVA膜是否和细胞紧密接触是重要影响因素。制作切片时应将切片厚度控制于8-9μm，以8μm效果，超过10μm因切片过厚则细胞发生重叠从而使细胞收集困难，同时要注意不能使切片产生褶皱，造成切片表面与EVA膜之间存在缝隙，影响捕获效果。在HE染色步骤中，二甲苯疏松时间、组织含水量及环境湿度等均可影响捕获结果。二甲苯疏松时间不足细胞较难从周围组织分离。对环境湿度和组织含水较多者应及时更换染液，适当延长乙醇的脱水时间。但过分延长脱水时间则使组织变的干燥松脆，出现帽子与切片不能紧密接触而无法捕获。在实验过程中梯度乙醇的最长脱水时间为2min。乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(EVA caps)应置于4-10℃、干燥环境妥善保存。如帽子受潮，则激光激发能量可被乙烯乙酸乙烯酯膜大部分吸收而非穿透，致使帽子与组织接触局部温度升高，产生组织和捕获细胞灼伤。从肿瘤组织类型看，腺癌的捕获收集成功率较高，可以达到91%；鳞癌相对较差，可能与鳞癌多有癌巢及角化珠形成、癌细胞与间质结合较为致密有关。考虑到正常肺泡及支气管上皮细胞体积相对较小、细胞分布相对稀疏，故正常对照组应多捕获约10个帽子，以保障病例和对照之间可溶性蛋白总量的均衡性。在所有蛋白质组学实验中，标本处理时间都是有严格要求的[9]。一般认为，组织标本超过30-40min常温暴露往往造成细胞内蛋白质大量降解而影响检测结果。在本实验中，我们使用改良的HE染色方法，较标准方法时间缩短14min，明显减少组织暴露时间。但从染色效果看，该方法对细胞核染色效果不佳、核浆的对比度较差；而且在腺癌染色效果与鳞癌和正常组织有所不同，其原因有待深入研究。有学者在乳腺癌等实体瘤标本中使用苏木精单染，其染色时间在30s[10]。我们在预实验中使用该方法发现，尽管用苏木精染色后时间可缩短，避免蛋白质降解，但随着捕获时间的延长，切片染色加深，导致细胞和间质不能很好区分，影响捕获效果。在LCM操作过程中将捕获时间控制在40min内，按照统一标准：Duration 15.5s的激光脉冲频率和平均8000 shots计算，既可保障每个帽子的细胞收集数量，也能够将实验时间尽可能缩短，从而使实验可控性提高使操作过程标准化。当然，从质谱分析的角度出发，通过LCM获取细胞的数量较小是该方法不可避免的缺陷[11]。因此，在后续实验中，选择适当的质谱方法应当慎重考虑。