引论：我们为您整理了13篇干细胞培养技术范文，供您借鉴以丰富您的创作。它们是您写作时的宝贵资源，期望它们能够激发您的创作灵感，让您的文章更具深度。
篇1
应用IV型胶原快速粘附法从手术切除的人包皮组织中分离表皮细胞中的快速粘附细胞，这一群细胞被认为是表皮干细胞，它具有快速粘附、缓慢生长的特点[2]。取年龄在5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片，无菌条件下去除皮下脂肪层，用含青霉素、链霉素的PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小约0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培养皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸弃上清，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网研磨过滤。滤液经1 000转/min离心10 min，弃上清，收集细胞。加入表皮干细胞培养基(每100 ml KSFM培养基加入0.05 mmol氯化钙100 μl、HKGS添加剂1 ml)并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37℃孵育15 min。倒置镜下观察，粘附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，吸出细胞悬液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干细胞培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长，2～3 d内细胞开始分裂，4～5 d后会出现许多细胞克隆或集落。培养基中钙离子的浓度是保持人表皮干细胞既增殖又不分化的关键。钙离子浓度过低，会导致所培养的人表皮干细胞生长缓慢或不生长;若钙离子浓度过高，则加速了细胞分化。我们在实验中筛选出适合的培养基中钙离子浓度，可以保证有效的培养维持。在培养过程中，还要经常检查培养箱温度和CO2的浓度，过低或过高的温度和CO2含量都影响人表皮干细胞的生长，容易出现细胞老化和衰退现象。为了避免各种细菌、真菌污染培养箱，每周用75%的酒精擦洗箱内的托盘、格架、箱壁。托盘始终装有一定量的饱和浓度磷酸氢二钠(Na2HPO4)液体，细菌既不能在其中生长，也能提供合适的湿度[3]。
2 人表皮干细胞的传代
当原代细胞达到70%～80%融合时，需进行传代，否则细胞会没有足够的生长空间，也会因为营养耗竭而影响生长[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞，置37℃温育5 min，必须经常在显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞部分漂浮起来，即可终止消化。加入2 ml终止液，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，按1∶2传代。传代细胞接种于IV型胶原预铺的培养瓶中。
3 人表皮干细胞的冻存
细胞不用或保种时，可将细胞冷冻保存在液氮中。细胞在培养基中直接降温冷冻，可因细胞内、外环境中的水而形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、渗透压改变、蛋白变性等，从而引起细胞死亡。因此，细胞培养基中要加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油。为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。一般用第2代人表皮干细胞培养至对数生长期时，用含胎牛血清的DMEM培养液将细胞配成5×106 /ml 的细胞悬液，1 000转/min，离心10 min，弃去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的冻存液，用吸管小心吹打，重新悬浮细胞，分装于2 ml冻存管中，将盖拧紧，用记号笔记好细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作人等。放入-70℃冰箱过夜后，再转入液氮罐中保存。注意：用于冻存的细胞应在光镜下观察生长状态良好，冻存细胞的体积不要超过冻存管体积的1/2。
4 人表皮干细胞的复苏
从液氮中取出冻存管后，迅速投入预先准备的40～42℃水中，并不时摇动，让细胞冻存液快速解冻1 min左右。取出冻存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出细胞悬液，加至10 ml离心管中，补加含胎牛血清的DMEM培养液，小心吹打使细胞分散悬浮。1 000转/min，低速离心10 min，弃去上清，加入表皮干细胞用的条件培养基适当稀释后，转入IV型胶原预铺的培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和水蒸汽培养箱中培养。复苏后要每天观察细胞状态，待细胞生长至适当密度时，及时分瓶培养或实验待用。
人表皮干细胞培养技术发展迅速，但诸如细胞在体外培养容易变形，多次传代后细胞克隆形成率明显下降，细胞逐渐分化难以保持原代细胞特性等问题，还有待更好地解决。
参考文献
1 Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage.J Cell Sci，1996，109 (Pt 5): 10171028.
篇2
压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。
1临床资料
注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。
方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。
2结果
原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。
3讨论
本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。
结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。
参考文献
[1]梁月有.诊断女性压力性尿失禁的相关检查[J].新医学.2006,37（10）:687-689.
[2]王萌.尿道周围注射治疗女性压力性尿失禁的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2006,26（6）：798-802.
篇3
1选取花蕾
一般在天气晴朗的8~10时取材,如遇阴雨天气,为了不影响试验进程也可取材,但一定要选取生长良好的花序,研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。尽量选取主花序或生长状态较好的花序,然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm的花蕾备用。不同的材料花蕾的发育时期不尽相同,可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期,最佳时期为单核晚期至二核期。花药为淡绿色呈透明状。取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取,应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。
2游离小孢子分离
先用75%的医用酒精将花蕾表面灭菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用无菌水冲漂洗3次,每次5min。将消毒的花蕾置于灭过菌的玻璃管中,加约2ml b5提取液,用灭菌玻璃棒将花蕾研碎,压出花粉小孢子,通过2层槽式无菌滤纸,或45μm的尼龙网,或0.22μm孔径的微孔滤膜过滤,把滤液倒入灭菌了的带盖的10ml离心管里,用滴管吸b5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉,冲2~3次后,在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释;将花粉悬浮液离心,800rpm,离心5min;将离心管中的上层清液吸去,再加液体b5抽提液,并将沉淀的花粉用吸管冲散,再次悬浮离心(用封口膜封口),1 800rpm,离心5min,吸去上层清液。
3小孢子加倍培养
将沉淀的花粉用nln-16 液体培养基稀释,稀释不要超过10ml,因为加倍后还要在10ml的离心管中再次稀释离心,倒入三角瓶在32℃条件下暗培养2d左右(48~72h);然后检查是否有污染,如果没有污染,则分皿继续培养。
4胚诱导培养
将加倍后的nln-16花粉悬浮液倒入离心管离心,800rpm,离心5min,倒掉nln-16液体;将沉淀的花粉用nln-13培养液稀释,稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿,一般每皿加入悬浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0个/ml,小孢子密度为10~50万个/ml,用封口膜封口;将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养,10d左右开始查看是否有可见的颗粒状胚,如果没有则继续培养[2]。
5胚状体培养
当肉眼可见的小胚状体出现时,把培养皿放在摇床上振荡暗培养5~7d,转速为80～100rpm。然后将鱼雷形、子叶形胚状体移植到b5固体培养基上,在25℃光暗交替条件下持续培养,诱导植株再生[3]。
6再生苗培养
培养1~2周后,见到子叶长大变绿,胚根伸长,长满白色根毛。继续培养后形成真叶,胚根不再伸长。当达到3～4片真叶时,再转移到生根培养基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培养基上进行扦插繁殖,获得完整植株。
7再生植株倍性鉴定
对再生植株进行细胞学鉴定(染色体数目)或在开花以后根据花器形态(雄蕊和花瓣形态)进行鉴定[4-7]。若是单倍体植株,需要再加倍培养成双倍体,可以把带有秋水仙碱溶液的脱脂棉盖在植株的顶芽、腋芽上;或者初花期把单倍体植株从土壤中取出,洗净根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙碱溶液泡1.5～8.0h,再移栽田间;或者胚状体再生获得的试管苗,在含10～100mg/l秋水仙碱的b5液体培养基中无菌培养4～8d,转到无秋水仙碱的b5培养基中培养7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。
8参考文献
[1] lichter r.introduction of haploid plants from isolated pollen of brassica napus l[j].zpflanzenphysiol,1982(105):427-434.
[2] 石淑稳,周永明,吴江生,等.
甘蓝型油菜小孢子培养、染色体加倍、试管苗继越夏和田间移栽配套技术的研究及其在油菜育种中的应用[j].中国农学通报,2001,17(2):57-59.
[3] 余凤群,刘后利.提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究[j].作物学报,1997,23(2):165-168.
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[5] 姜凤英,冯辉.羽衣甘蓝游离小孢子培养初报[j].园艺学报,2005,32(5):884.
[6] 石淑稳,吴江生,周永明,等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究[j].中国油料作物学报,2002,24(1):1-5.
篇4
METHODS: The tissue of ciliary body of postnatal 10 days rat was isolated and pided into small bits， then cultivated with nonserum DMEM/F12 medium， 20μg/L bFGF， 20μg/L EGF and 1×B27 supplement at the same time， the embryonic brain derived neural stem cells (NSC) were isolated and cultivated with routine method as positive control. These two kinds of cells were identified by detection of nestin with immunofluorescence method， which was known as a marker of neural stem cells. The characteristic of differentiation of RSC was identified in the induced condition of 100mL/L FBS medium.
RESULTS: In the primary cultivation， cell spheres with high refraction were observed 48 hours after isolation and cultivation. The cell spheres enlarged and the amount increased gradually in the fourth or fifth day of cultivation. The passage of the cells occurred in the seventh day of cultivation， and the cells of the next passage can also formed the sphere shape. The marker nestin was detected both in RSC and NSC by immunofluorescence method. The RSC became adherent with the bottom of the culture dish in the induced condition with serum， and some of the cells differentiated into cells with neural cell shapes. The characteristics of the shape， proliferation and differentiation of RSC were similar with NSC.
CONCLUSION: Tissue cultivation has the characteristics of less damage and convenience， which can be used in the isolation and cultivation of RSC successfully.
视网膜干细胞(retinal stem cell， RSC)是近年来发现的成体干细胞之一。RSC在体外培养中可自我更新和增殖，亦具有多向分化的潜能，可在一定条件下诱导分化成为神经元细胞及神经胶质细胞。RSC在体外培养、分化与移植方面的研究进展为我们最终应用这些研究成果来有效的治疗致盲性眼病带来了希望，因而，成功对其进行分离，体外培养及鉴定则为进一步研究其分化机制及细胞治疗、基因治疗奠定基础。图1原代干细胞(IM×100) A:视网膜干细胞;B:神经干细胞。图2Nestin免疫荧光染色阳性(IF×100) A:第2代视网膜干细胞;B:第2代神经干细胞。
1材料和方法
1.1材料
孕18d Wistar大鼠及出生10d鼠，由吉林大学动物中心提供。DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)，B27添加剂(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、EDTA(Sigma公司)，神经巢蛋白(nestin)兔抗大鼠多克隆抗体，FITC羊抗兔抗体(武汉博士德公司)， CO2培养箱(日本SANYO公司)，倒置相差显微镜( Olympus)，超净工作台(苏州净化设备厂)等。
1.2方法
将出生10d的Wistar鼠断颈处死后置于750mL/L乙醇中消毒5min，取出眼球，浸泡于DMEM/F12培养液的培养皿中。更换新的无菌器械，在解剖显微镜下，首先剔除眼球外组织及视神经，在角巩膜缘后3～4mm处环形剪开眼球，仔细去除晶状体、玻璃体及视网膜。取出睫状体组织放入另一无菌皿内，应用微观剪刀尽量将组织剪成碎块，加入DMEM/F12培养液吹打均匀，移入24孔板中培养，并于孔板中加入20μg/L大鼠表皮生长因子(EGF)，20μg/L大鼠碱性成纤维生长因子(bFGF)及1×B27添加剂，于37℃，50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养。每天以倒置显微镜观察细胞形态变化和生长状况。当细胞形成较大团体时予以传代，首先离心收集细胞，用2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶500μL消化细胞约2min，以含100mL/L胎牛血清的培养液中止消化，用移液枪吹打使细胞分散，离心去上清后，应用DMEM/F12培养液洗涤1遍，按1∶2比例传代，每3d半量换液，约7d传代1次。应用免疫荧光法对RSC及对照组神经干细胞进行鉴定。分别应用多聚赖氨酸处理的玻片进行细胞爬片，取出玻片，以0.1mol/L PBS冲洗1次，应用40g/L多聚甲醛固定20min，以PBS冲洗5min×3次，2g/L Triton 100作用10min，0.1mol/L PBS洗4min×3次，加入血清室温封闭20min，倾去血清，加入一抗 (1∶100)孵育过夜(4℃)， PBS洗3次，每次5min。空白对照用PBS代替一抗。加入FITC标记的羊抗兔抗体，避光室温放置30min，0.1mol/L PBS洗3次，每次5min。中性树脂封片，荧光显微镜下观察。另取孕18d大鼠，脱颈处死后浸泡于750mL/L乙醇5min。用碘酊及750mL/L乙醇进一步消毒小鼠腹部，无菌器械剪开孕鼠腹部皮肤，取出受孕的子宫，移入呈有PBS液的培养皿中。PBS液冲洗两遍，剪开离体的子宫，取出胚胎，应用眼科剪剪开头骨，小心将脑组织移入另一培养皿中，应用DMEM/F12培养液冲洗，去除脑膜及血管，并应用微观剪刀将组织剪碎，移入加有1mL 2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶的离心管内，置于37℃下消化15min，每5min振荡1次。加入含有100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，离心弃上清，应用无血清DMEM/F12培养液洗涤1遍，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，以密度为109 /L将细胞接种于6孔板中，培养条件同RSC。收集第2代RSC及神经干细胞，应用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液诱导分化，37℃，50mL/L CO2、饱和湿度条件下培养，倒置显微镜下观察其分化情况。
2结果
2.1大鼠视网膜干细胞
分离培养48h后开始在组织块旁出现细胞团，大小不一，由数个单个细胞构成，折光性强，呈球形或者桑葚状悬浮生长(图1A)。培养至4～5d后，悬浮生长的细胞团数量逐渐增多、增大。原代细胞培养至6～7d细胞团数量达到高峰。传代时去除组织块及杂细胞，48h即可形成新的细胞团，形态与原代相似，随传代次数增加细胞团数目增加逐渐变缓。取第2代RSC及神经干细胞进行nestin免疫荧光染色，镜下可见RSC呈现阳性的绿色荧光，空白对照组无荧光显示(图2A)。神经干细胞nestin免疫荧光染色亦显示出阳性绿色荧光，与RSC表现相似，空白对照组无荧光显示(图2B)。
2.2大鼠神经干细胞
胎鼠脑组织细胞悬液培养孔内可见培养48h后多数细胞团形成，折光性强，呈球形或者桑葚状悬浮生长(图1B)。培养至4～5d后，悬浮生长的细胞团数量增多，出现较大的细胞团，细胞团间可见融合现象。原代细胞培养至6～7d细胞团数量达到高峰。传代后48h形成新的与原代相似的细胞团。与RSC相比，其细胞团增殖速度较快。图3干细胞体外诱导分化为神经样细胞(IM×100) A:视网膜干细胞;B:神经干细胞。
2.3干细胞体外的诱导分化
取第2代RSC及神经干细胞应用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行诱导分化， 3d可见大部分RSC贴壁生长，部分细胞开始长出小突起， 7～10d细胞突起逐渐增长成条状，呈典型的神经元形态(图3A)。第2代神经干细胞的表现与RSC相似，但其细胞形成突起更为明显，其具有神经元外观的细胞较RSC增多，且细胞之间连接成网状(图3B)。
3讨论
在以往的研究中，人们发现在部分脊椎动物的视网膜边缘，接近睫状体上皮的结合部存在着少量的RSC。在鱼和两栖类动物中，RSC可终生不断生长，持续产生前体细胞，在原有视网膜的周边产生新的视网膜，并可在视网膜损伤时增殖、分化以修复更新受损细胞。此外，人们发现在鸟类视网膜周边部的睫状边缘带也存在着不断增殖分化的RSC，但其产生新生视网膜的能力受到限制[1]。以往认为，哺乳动物中缺乏RSC，近年来的研究证实，胚胎鼠视网膜包含着在体外具有干细胞特性的祖细胞，这些细胞除可增殖并表达神经外胚层标记外，还具有多向分化潜能[2]，而且随着研究的不断进展，目前，研究者们已成功的从多种成年哺乳动物及人类的睫状体区域分离、培养出RSC。这些培养的细胞具有可自我更新、增殖的能力，在一定条件下可分化成为神经细胞、光感受器细胞等某些类型的视网膜细胞[36]，而且近年来研究证明经某些特定基因修饰后视网膜细胞将向特定类型的视网膜细胞分化[79]，RSC的研究进展为视网膜发育的具体机制研究及视网膜损伤疾病治疗带来了希望。
存在于睫状体色素上皮层的RSC由于数量少、部位隐匿，给分离、培养带来一定的困难。目前对RSC仍没有固定的分离培养方法，其培养条件多与脑源性神经干细胞相似，为了抑制干细胞分化常应用无血清培养基，常用的培养基为DMEM/F12(1∶1)。为保证培养细胞持续增殖、更新、保持去分化状态，还需要有丝分裂原(常用bFGF及EGF)。而且，还可添加培养神经细胞所需的多成分复合营养物质B27或N2以促进细胞生长。目前RSC的分离培养方法主要应用机械酶消化法，即先将组织剪成小块，再应用胰酶等酶类进行消化，最终得到单细胞悬液。但在酶消化过程中，为防止消化过程中细胞损伤，很难把获取组织块完全消化成单细胞，因此有时消化所获得的目的细胞较少。我们应用眼科微观剪刀将组织尽量剪成小块，直接置入培养皿内并加入培养基进行培养，避免了酶消化对于细胞的损伤，而且简化了操作步骤，减少了细胞的流失及实验污染的机会。培养48h即可发现较小的组织块周围开始不断有细胞迁移出来，而且在首次传代时用吸管吹打就可获得较多的单细胞，然后再用滤网过滤即可除去杂质，得到较为纯净的细胞团。本实验证明，应用组织块培养法从睫状体区分离、培养出的细胞团具有自我更新及增殖的能力，且免疫荧光法证实其与脑源性神经干细胞相似，均表达神经干细胞标记物nestin，传代后细胞的增殖潜能及nestin的表达无明显衰减。细胞在去除生长因子且存在血清的培养条件下与脑源性神经干细胞表现相似，可诱导分化成具有神经细胞形态的细胞，体现了其在一定条件下具有分化能力。因此，我们认为，组织块培养法适合于来源于睫状体区视网膜神经干细胞的分离培养，可以从少量实验标本中较为简单、快捷的体外扩增出大量的细胞数目以进行进一步的深入研究。
参考文献
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篇5
一、信息技术发展对妇幼保健院政工干部培养的影响
1.信息技术发展对政工干部素质提出了更高的要求
信息技术的发展使得信息化素质成为政工干部的基本素质之一，妇幼保健院的政工干部也不例外。信息化素质是指主体所拥有的各种信息品质，包括信息智慧、信息道德、信息意识、信息觉悟、信息潜能和信息心理等内容。信息化素质能让政工干部跟上时展的潮流，掌握最新的信息技术，也能让政工干部认识到信息的重要性而自觉地利用信息提高工作质量，培养政工干部终身学习意识。妇幼保健院作为医疗体系的一部分，一些医疗技术和医疗设备更新速度很快，政工干部必须具备较高的信息化素质才能捕捉到这些信息。具体来说，信息技术的发展要求妇幼保健院的政工干部全面提高自身素质，学好信息知识、掌握信息技能的同时，还要学习政工理论知识、医疗专业知识及人文社科知识等，培养政工干部的领导管理能力、沟通交流能力等。
2.信息技术发展对政工干部素质培养提供了新的条件
信息技术的发展改变了传统的信息的载体形式，拓宽了信息传播的渠道，极大地缩短了信息传播所需要的时间，使个人获得信息的成本大大降低，为政工干部的培养创造了有利的条件。首先，政工干部学习、沟通渠道更广。妇幼保健院可以在政工干部的培养课程中使用各种计算机辅助教学方式，它使课程内容更加生动有趣，能更好地激发政工干部的学习兴趣；依靠网络教学的方式还可以让政工干部充分利用网上丰富的信息资源，相互交流学习；此外政工干部还可以合理安排自己的学习时间，选择自己的学习方式，培养方式更加个性化。其次，政工干部利用信息的方式发生了改变。过去妇幼保健院的政工干部获取信息主要靠阅读各种纸质材料，现在政工干部阅读的载体扩展到网络信息，从文字扩展到图像、声音、三维等；在表达方式上实现了从直接手写到键盘输入、扫描等，包括直接复制或者删减其他文件；在计算方式上也不再需要人工计算，利用计算机准确又迅速减轻了政工干部数据统计分析的负担。
3.信息技术发展对政工干部素质培养带来的问题
首先，信息鸿沟现象比较严重。在妇幼保健院的政工部门中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用现代信息技术方面也存在较大差异，这给政工干部的信息培养课程增加了不小的难度。其次，网络信息量过于庞大。信息技术的发展使得，各种信息都能在网络上迅速传播，过量的信息会使人们很难找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是严重影响政工干部的培养工作。
二、提高妇幼保健院政工干部培养质量的对策
1.定期完善政工干部培养方案
信息技术的发展变化是日新月异的，妇幼保健院要保证政工干部的培养紧跟时代的步伐就必须根据时代的变化对培养方案和教学计划进行全面的调整和修订，但是不能改变的是要始终强调培养信息化素质的重要性。培养方案的完善和修改可以从以下几方面入手：教学目标、教学内容、教学课程专题、教师师资、教学材料和教学组织形式等，要突出强调信息化素质的地位。
2.精心设计培养的专题体系
妇幼保健院政工干部培养的基本平台就是课程专题，怎样设计合理的课程专题也成为政工干部培养工作的难题，可以明确的是必须要依据信息技术的发展对各类政工干部知识能力素质的客观要求来建立课程专题体系，同时也要根据不同教学对象的性质、层次和类型做出调整。要根据政工干部的培养目标确定专题的类别和课时比例，各类专题都有围绕解决新时期思想政治教育工作来设计，专题设置和内容都要做到内容精干、素材新颖、实在管用，不仅要包括信息化知识和技术的课程，还要有其他方面的课题。
3.打造政工干部培养的环境条件保障体系
妇幼保健院可以从以下几个方面来支持政工部门的信息化工作。首先，配置完备的教学设施设备，包括计算机及网络、多功能教室等。其次，建设多样的信息化教学信息资源子系统，例如数字化图书馆信息资源、课程网络信息资源、教学管理信息资源等。
总之，为了让信息技术的发展更好地为妇幼保健院的政工干部培养工作服务，需要站在全局的高度将信息技术理论和方法应用到培养的全过程中，需要对政工干部培养的形式、内容、方法进行深刻变革，以提高政工干部培养的效率，全面提高政工干部信息化素质培养的质量和效益。
参考文献：
[1]周军、夏婷婷，论信息技术发展对政工干部培养影响及其对策，中国信息界，2012（05）
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细胞的悬浮培养可谓是理想的大规模细胞培养方式，悬浮培养技术是在生物反应器中，在人工条件下，高效率大规模的培养动物细胞进而应用于生物制品生产的技术，可根据细胞的贴壁能力分为微载体悬浮培养方式和全悬浮培养方式。
1. 微载体悬浮培养。MDCK 细胞是从犬肾分离出来的一种贴壁依赖性上皮细胞，且它具有典型的“失巢凋亡”现象，即一种特殊的细胞程序死亡，是由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的，也就是说依靠传统的驯化方式或者单纯的用机械搅拌使MDCK 细胞悬浮生长难度相当大。Van Wezel 创立的微载体悬浮培养系统开创了细胞体外大规模培养的先河，更为准确的说是使贴壁细胞大规模培养成为现实。微载体悬浮培养是一种先进的贴壁细胞培养技术，其原理是将对细胞无害的颗粒加入到生物反应器的培养液中，作为载体，使细胞能在微载体表面附着生长，同时加以持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。反应器中使用微载体是一种可以提高细胞浓度的策略，其细胞密度可达1×107 cells/ml。
采用微载体培养MDCK 细胞，结合了悬浮培养与贴壁培养的优点，包括（1）细胞贴壁表面积大大增加，培养基利用充分，细胞密度增大。（2）微载体可在搅拌停止时沉降，便于将培养基与细胞分离。（3）与方瓶贴壁培养时的代谢变化不大，正常培养基可通用等等。
但是，目前生物反应器微载体培养研究只是单批次的培养，其消化放大培养依旧是难题。且微载体培养过程中一般添加了血清，给下游纯化带来了巨大压力。采用商业无血清培养基，会大大增加企业生产成本。因此，自主开发无血清培养基进行MDCK 细胞悬浮培养是目前的发展趋势。
2. 无血清单细胞悬浮培养。我们知道，生物制品生产尤其是细胞培养方法生产病毒疫苗的过程十分严谨。细胞培养需添加血清，可是血清的加入无疑给生产后期的除杂纯化等工艺带来难度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解为成熟的HA1 和HA2，能够介导病毒囊膜和靶细胞膜结合，病毒开始繁殖，而MDCK 细胞本身不具备裂解HA 的蛋白酶类，所以常常添加胰蛋白酶来提高病毒产量，但是，细胞培养中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，这种矛盾致使MDCK 无血清培养问题更亟需解决。目前，MDCK 无血清培养已经取得了很大的进展，基本思路是在基础培养基的基础上补加各种生物活性因子来替代血清，结合细胞生长所需成分，配制出无血清培养基， 能够支持MDCK 细胞正常生长增殖。一般常见的营养添加因子有：胰岛素，人转铁蛋白，氢化可的松等等，再经过对这些添加因子的添加量的优化，最终确定无血清培养基成分。
现在，已有MDCK 细胞商业用无血清培养基，它们的成功问世解决了这一大难题。通过直接法或间接法，即：原含血清培养贴壁细胞直接消化传代换成无血清培养基培养或逐步降低血清浓度直至降到无血清培养，使MDCK 细胞适应无血清培养基，生长状态优良且能正常增殖传代。
完成了MDCK 无血清培养后，MDCK 单细胞悬浮培养仍在研究当中，有文献报道，已有驯化成功的MDCK 悬浮细胞系，但就市场应用来看，是远远不够成熟的。现阶段，驯化MDCK 细胞在适应了无血清培养基培养的基础上，对其进行单细胞悬浮培养驯化方法主要有以下几种：（1）使用硅化方瓶培养：将细胞培养方瓶先用硅化剂处理，防止了细胞的贴壁，再通过调整培养基成分，使细胞增殖；（2）使用摇床或摇瓶体系，通过外力作用，防止细胞贴壁，再对细胞进行筛选，然后扩大培养。
二、 MDCK 细胞应用于流感病毒疫苗生产
采用细胞系培养流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生产方法，市场销售的一些贴壁细胞系如Vero 细胞，MDCK 细胞是应用于流感疫苗研究最典型的哺乳动物细胞系，经研究，这些宿主细胞产生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，从相应的细胞培养生产的疫苗免疫应答效果和用鸡胚生产的疫苗一样好。MDCK 细胞应用于流感疫苗生产有很多优点：MDCK细胞易培养、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效扩增流感病毒；MDCK 细胞生产的疫苗可以应用于对鸡胚蛋白过敏的患者等等。在使用MDCK 贴壁细胞接流感病毒后，通常会有较高的细胞特异性产率；微载体悬浮培养的MDCK细胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高达9log2（1∶512）；就已知实验室用驯化出MDCK 悬浮细胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于贴壁细胞系。且已有疫苗厂商如Solvay 制药公司采用无血清培养基、微载体技术制备出了MDCK细胞流感亚单位疫苗；诺华公司制备出了由MDCK 细胞培养生产的流感疫苗Optaflu。
三、展望
在过去十几年中，用动物细胞培养制备流感疫苗生产方式已经替代了传统的使用鸡胚生产方式。动物细胞培养生产流感疫苗的特征在于其灵活性和可扩展性，然而，贴壁细胞易培养但是却很难扩大生产量，而如果使用微载体提供生长表面又会大大增加其成本。所以要努力创建悬浮细胞系，特别是MDCK悬浮细胞系。
多年以来，监管部门督促行业设立无血清培养流程，以避免污染。
然而，许多市售培养基仍然需要添加物，以达到高细胞密度和最大产物产量。理想的情况是，在疫苗生产中应该使用不需添加另外的蛋白质等混合物的已知成分的培养基。这不仅会降低批次变化的风险也有利于病毒收获的下游处理。此外，疫苗生产过程可以被简化，可以直接接毒而不用更换培养基。
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关键词：乙醇； 肝细胞； 原代培养； 黄芩茎叶总黄酮； 保护作用
The Protective Effect of Total Flavonoid in scutellaria baicalensis Stem-Leaf on Primary Cultured Mice Hepatocytes Injured by Ethanol
Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoid in Scutellaria baicalensis stem-leaf (SSTF) on primary mice hepatocyes injured by ethanol. MethodsPrimary hepatocytes were isolated， cultured by trypsin digestion and induced by ethanol. Various concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes for 12h.The content of malondialdehyde(MDA) in hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods，the viabilities of hepatocytes were measured by MTT.ResultsThe elevation of MDA content of hepatocytes and ALT level in supermatant of cultural hepatocyes were restored remarkably by SSTF， hepatocytes viability was improved significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary mice hepatocyes injured by ethanol.This might be associated with its anti-lopoperoridation.
Key words：Ethanol; Hepatocytes; Primary cultured; SSTF; Protective effect
肝脏是酒精代谢的主要脏器，过量饮酒可造成肝脏不同程度的损害，并进一步发展为脂肪肝、肝纤维化和肝硬化，严重危害人类健康。了解酒精性肝损伤的发病机制，筛选有效预防和治疗的药物应用于临床，是当前面临的重要课题。黄芩茎叶总黄酮(SSTF)是我院中药所对黄芩的茎叶部分提取的有效成分，整体实验已证实其对肝损伤有保护作用［1］。本文建立体外乙醇性肝细胞损伤模型，在细胞水平上进一步研究乙醇性肝损伤的机制及SSTF对肝细胞保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂SSTF（含总黄酮73%）：承德医学院中药研究所提供，临用前以蒸馏水配制，用饱和碳酸氢钠调pH=7.6；Hanks液高压灭菌，4℃保存；0.8 g・L-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液：RPMI 1 640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 u・ml-1，链霉素100 μg・ml-1，胰岛素5 μg・ml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。
1.2 动物昆明种小鼠，1~3 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。
1.3 仪器CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。
1.4 肝细胞分离培养［2］取新生小鼠30只，断头放血，无菌分离肝脏，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm3左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8 g・L-1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1000 r/min离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个・L-1，接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养。
1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板培养24 h更换培养液，设正常对照组，25，50，75，100 mmol・L-1四个乙醇组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，TBA法检测MDA含量，MTT法测定肝细胞存活率。
1.6 SSTF对诱导肝细胞损伤的作用取上述培养24 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SSTF(100，200，300 mg・L-1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SSTF组加入乙醇100 mmol・L-1，同时SSTF组加入不同浓度的SSTF，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性和MDA含量，MTT法测定肝细胞的存活率。
1.7 统计学处理数据以±s表示，用SPSS11.5计算机软件进行统计学分析， 组间比较采用t检验，P
2 结果
2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol・L-1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol・L-1乙醇作用最明显。
表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响（略）
与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SSTF对乙醇损伤肝细胞的保护作用100 mmol・L-1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量较对照组明显增高；而给予SSTF保护后， ALT水平明显降低，MDA含量亦明显降低，肝细胞存活率明显升高，并呈现剂量依赖性(P＜0.05或P＜0.01)。显示：SSTF能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。
表2 SSTF对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA水平及细胞存活率的影响（略）
与对照组比较，*P＜0.01，与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 讨论
乙醇本身和它的氧化物乙醛对肝细胞有直接毒性作用［3］。乙醇进入机体后，在肝细胞乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、细胞色素P450等作用下产生氧自由基，氧自由基除直接损伤肝细胞外，还可通过增加肝细胞对脂质过氧化的敏感性，导致细胞膜和细胞器破坏，肝酶逸出，细胞死亡［4］。ALT是肝细胞内主要酶之一，肝细胞膜损伤时，细胞内ALT释放量增加，因此检测培养液中ALT活性是判断肝细胞膜损伤最明显的标志［5］，MTT法检测细胞存活情况可直接反映细胞损伤程度，MDA是肝细胞脂质过氧化的最终产物，其含量高低可反映膜脂质过氧化程度的强弱和肝细胞损伤的程度［6］。我们在研究中发现，低剂量酒精对肝细胞损伤不明显，ALT水平和MDA含量变化不大，随着酒精浓度的增加，细胞培养液中ALT呈进行性升高，细胞存活率逐渐下降，并且MDA含量也呈现进行性增加，表明过量饮酒可引起肝细胞氧化损伤。为了充分证实SSTF对酒精性肝损伤的保护作用，我们以100 mmol・L-1乙醇制备小鼠肝细胞损伤模型。结果表明，在酒精损伤的肝细胞中加入SSTF后，肝细胞损伤明显减轻。随着SSTF剂量增加，培养液中ALT水平逐渐降低，肝细胞存活率明显升高，与模型组比较，差别显著（P
参考文献
［1］ 李素婷，杨鹤梅，石艳华，等.黄芩茎叶总黄酮保肝作用的实验研究［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（7）：593.
［2］ 丁 虹，彭仁，张卫国，等.对乙酰氨基酚对小鼠原代培养肝细胞损伤及阿魏酸钠的保护作用［J］.中国药学杂志，1997，32（4）：210.
［3］ Sergent O，Pereira M，Belhomme C，et al.Role for membrane fluidity in ethanol-inducde oxidative stress of rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther，2005，1:5.
［4］ Hock J B，Pastorino J G.Ethanol，oxidative stress，and cytokine-induced liver cell injury［J］.Alcohol，2002，27(1):63.
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被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”
本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：
1．试管婴儿
【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。
体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:
哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：
例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）
A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养
B. 从良种公牛采集的需进行获能处理
C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚
解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。
答案：D
例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：
（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。
（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。
答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）
（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：
细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：
（1）图中所涉及的现代生物技术有、和
等。
（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）
A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行
（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。
（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。
（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。
（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?
。为什么？
解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
3．生物技术中的伦理问题
【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。
例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：
（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。
（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。
（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的
，原因是这些细胞 。
（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。
（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。
解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。
答案：（1）次级卵母（卵） 核移植
（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应
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Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium
MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2
1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China
[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.
[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR
表皮干细胞为皮肤组织中的专能干细胞，是一种成年组织干细胞[1]，可增殖分化为表皮中各种细胞成分，保持皮肤正常的表皮结构。表皮干细胞的分化方式有两种：对称分裂和不对称分裂。前者分裂成两个和母细胞相同的子代干细胞；而后者则分裂成一个子代干细胞和一个与母细胞不同的短暂扩增细胞（TAC）[2]，TAC属定向祖细胞。近年来干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新途径，可替代、修复、加强受损的组织或器官的功能[3]。本研究应用组织工程学技术将表皮干细胞体外定向诱导分化为结膜上皮细胞，通过对目的细胞生物特性的检测，探讨其在临床眼表结膜重建治疗中的应用前景。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1人皮肤材料包皮标本来自中山大学第一附属医院泌尿外科包皮环切术患者，无泌尿系统疾病感染，患者年龄18～30岁，所取包皮标本均得到患者知情同意。
1.1.2结膜组织取自尸体眼正常结膜组织。
1.1.3试剂和仪器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；荧光定量试剂盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）购自TaKaRa公司（美国）；TRIZOL® Reagent RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司（美国）；RNA提取反转录PCR试剂盒购自Promega公司（美国）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR仪（Stratagene公司，美国）；MJ Research OpticonTM4荧光定量PCR仪（美国）。
1.2方法
1.2.1饲养细胞的培养取尸体眼结膜，用加有1×103U/mL青霉素不含钙镁的PBS缓冲液冲洗3遍，于无菌超净台剪除结膜下筋膜组织，将其上皮面向上平铺于无菌培养皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，弃去消化液并用无菌虹膜恢复器刮取上皮组织，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化约20min，待倒置显微镜下见到上皮细胞充分消化为多个单细胞状态时加入上皮细胞培养液中止消化，收集细胞悬浮液，置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化的结膜上皮细胞，将其调整为1×104个/mL，在6孔Transwell培养板insert池中加入1mL结膜上皮细胞悬液饲养细胞组为实验组，对照组insert池中无饲养细胞，仅为相同体积的上皮细胞培养液。
1.2.2表皮干细胞的分离、筛选、培养取无菌手术获得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含钙镁的PBS缓冲液冲洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L两性霉素不含钙镁的PBS缓冲液浸泡30min，无菌超净台剪除皮下组织，并剪成2mm×4mm皮条，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃过夜。次日用眼科镊撕取表皮皮片，D-Hank’s液冲洗3次，并用眼科显微剪将其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使细胞脱落，加入上皮细胞培养液中止消化，200目细胞筛过滤得细胞悬液，收集细胞悬浮液置于离心管内，以1500r/min离心5min，获得消化所得的皮肤上皮细胞。将其以1×106个/mL密度接种于Ⅳ型胶原（100μg/mL）铺底的培养瓶置于5% CO2、37℃细胞培养箱中待细胞贴壁20min后，去除未贴壁细胞，加入新的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养，1～2d换液一次。
1.2.3表皮干细胞与结膜上皮细胞共培养的诱导分化取1～2代表皮干细胞作为实验细胞，以5×106个/mL接种于6孔Transwell培养板中，实验组insert池中加入1mL结膜上皮细胞（细胞浓度为1×104个/mL）作为饲养细胞；对照组insert池中仅为相同体积的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养1、3、5、7d后，弃细胞培养液，分别取对照组和实验组细胞提取RNA，进行实时定量RT-PCR检测目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表达情况。
1.2.4细胞总RNA的提取吸出6孔Transwell培养板中的培养液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振荡混匀，15～30℃温育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃离心样品15min（＜12 000g），将上层水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃离心（＜12 000g），弃上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗涤，振荡样品，然后7 500g离心样品5min（如果用来富集小分子RNA，则不用75%乙醇洗涤，直接进入下一步），空气干燥RNA 10min，用适量RNase free水溶解，于60℃温育10min，置于-80℃备用。
1.2.5引物的构建按照参考文献[4]构建设计：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。
1.2.6PCR扩增取3μL逆转录反应产物做模板，根据试验目的加入相应的正向引物和反向引物。PCR反应总体系为20μL。条件为95℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30个循环；72℃ 10min，1个循环。
1.2.7荧光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM试剂盒的说明书进行。取1μL逆转录反应产物做模板，20μL反应体系，引物浓度为10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用双蒸水补平至20μL。反应程序为94℃ 10s，1个循环；94℃ 5s，58℃ 31s，读板，40个循环。数据分析采用2-CT方法。
2结果
Realtime RT-PCR的结果见图1、图2。结果可见实验组表皮干细胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表达明显上调，分别为（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表达上调（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。与对照组相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表达都有显著性上调。
图1表皮干细胞中β2-微球蛋白mRNA的表达水平5d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调（300±26）%（P＜0.01）；7d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6
图2表皮干细胞中CK13 mRNA的表达水平5d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调（480±110）%（P＜0.01）；7d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6
3讨论
角蛋白（keratin）是上皮细胞异性的中间丝成分。已知的细胞中表达的各种角蛋白家族亚单位成员具有组织特异性，并且和细胞的分化相关[5]。例如：Krenzer等[6]报道：在正常结膜上皮细胞中表达角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究报道：通过对38例正常结膜组织的上皮细胞建立的cDNA文库，检测出角蛋白K13是结膜细胞转录中表达最丰富的基因，且该基因与细胞骨架的合成有关，并认为K13有可能是有关眼表结膜细胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也证明：在结膜上皮细胞的免疫组化鉴定中结膜上皮细胞可被特异性角蛋白K13抗体标记，而在皮肤干细胞中并无相应抗体的表达[8]。
β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。虽然有关该种蛋白的功能尚未明确，但是该蛋白存在于泪液中并可能来源于结膜上皮细胞中。并且在正常状态下泪液中的β2-微球蛋白浓度明显高于炎症时泪液中浓度。Dota等[7]研究中也同时检测到β2-微球蛋白也是结膜上皮细胞转录较高的基因，因此本研究将CK13和β2-微球蛋白作为结膜上皮细胞标记性（特异性）的高效表达基因。
近年来，相关文献[9-11]报告了通过组织工程技术将成体干细胞体外合成生物替代品，并对其组织功能改良用于眼表重建的临床治疗新技术。然而，成功的眼表重建依赖于两个重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干细胞；其二，干细胞的载体组织。本研究中应用具有高分化、高增殖能力的表皮干细胞为种子细胞，从而保证眼表重建治疗中能获得可靠的细胞源。我们早期的相关研究中[4]报告应用同源异体的结膜去细胞基质膜为干细胞载体膜，不仅可保证具有良好的组织相容性，而且也确保在体外模拟形成结膜上皮细胞增殖的组织微环境。从而诱导表皮干细胞定向分化、增殖。
研究结果显示经诱导分化的表皮干细胞在短时间内具有结膜上皮细胞的特异性基因CK13及β2-微球蛋白的高表达，提示该实验方法可诱导表皮干细胞形成特异性短暂扩增细胞（TAC），并能定向分化为类结膜上皮细胞。因此，在临床上眼表重建的干细胞疗法应用中，该方法不仅可保证获得充足的目的细胞来源，而且确保目的细胞具有稳定的生物学特性。在眼表结膜组织的重建及生理功能恢复的临床治疗中提供有效的组织来源。但是，该研究方法中诱导分化的表皮干细胞作为种子细胞能否合成人工结膜生物膜活体动物眼表的存活状况及生理功能重塑方面的问题，还需要进一步的研究探索。
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篇10
1 无血清培养体系简介
无血清培养体系是在合成培养体系的基础上发展而来的，主要是寻找替代血清的各种可能性，使无血清培养既能进行细胞培养，又可以避免血清带来的不利影响。与含血清培养相比，具有很多的优点，无血清培养技术的发展是从上世纪七十年代开始的，其中基于生产安全性的重组药物而开发的无血清培养基，不用动物做为蛋白来源，降低了成本也加快了报批的速度，后来逐渐发展成为培养基的组成成分全部为化学已知物，更易进行目标蛋白的分离纯化，要求培养的细胞要具有较高的特异性。
一般无血清培养体系由基础培养和替代血清补充因子两部分组成，其中基础培养是零添加血清的合成培养基，按照细胞的生长要求将各种微量元素和营养物质进行合成为基础培养基。补充因子是代替血清的各种因子，包括激素、生长因子、结合蛋白等，在所有的补充因子中，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠是细胞在无血清培养基中生长所必须的，是必须具备的补充因子。
2 无血清培养体系在再生医学领域的应用
2.1 无血清培养基研制配方的应用
研究人员研究发现在无血清合成输卵管液培养基中加入胰岛素、转铁蛋白和硒，可以提高动物胚胎的发育质量，再加入牛血清白蛋白后，可以促进囊胚的发展，可以促进细胞的增殖实验。CHO、Vero等工程细胞是单克隆抗体和基因工程药物的表达载体，在对无血清培养基的研制时，要满足增殖的需要，同时也要表达目的产物。例如CS-NS0细胞是抗-CD25单克隆抗体的表达体，无血清低蛋白培养基可以满足大规模培养和抗体表达的要求，批培养最大活细胞密度和最大抗体浓度都达到很高。基于人胚肾细胞培养的无蛋白培养基，可以用于对抗聚乙烯介导转染慢病毒，具有较高的滴度，成本也较低。针对Vero细胞源乙型脑炎疫苗而研制的无血清培养基，没有任何动物源性成分，疫苗只要添加稳定剂，就可以在常温下保存。
2.2 无血清培养体系在细胞增殖方面的应用
雌二醇是无血清培养基中经常添加的激素，如果其浓度较高，会抑制毛囊的生长；PDGF、TGF-β、FGF是三种信号通路，可以促进间质干细胞的生长分化，如果其中之一受到抑制作用会影响间质干细胞的生长，如果三种信号通路结合好，则会使间质干细胞在培养基中传到五代。如果无血清培养基钙浓度较低，下调Smad蛋白介导会维持角膜基质细胞的表型，角膜的上皮细胞也可以长期进行传代培养。中草药是我国的传统医学代表，细胞无血清培养技术也影响到中草药的作用机制，研究显示黄芪可以增加人皮肤表皮干细胞将粒酶转化为录酶，并增强其活性。
2.3 无血清培养基在细胞和组织移植中的应用
无血清培养体系安全性较高，所以广泛应用于基于生物细胞培养的细胞或组织移植治疗中。在无血清培养基中培养骨髓基质干细胞，可以获得与含血清培养基相同的增殖效果，如果患者属于特殊贫血类型并且体重较轻，可以诱导人体成骨，并可以抑制异位骨，这方面比含血清培养更具有优势。采用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞，可以在无血清培养的条件下抑制细胞的凋亡，使骨髓间充质干细胞可以存活于下肢缺血性疾病的治疗中。
如果某些细胞和组织具移植的可能性，如果研制的培养基可以长久的维持细胞特性，这将会促进移植的成功率。新鲜刚分离的肝细胞具有特有的分化属性，此属性如果存在于含血清培养基中就会丧失掉，如果在无血清培养基中添加地塞米松、表皮生长因子、垂体提取物等，肝细胞就会保持3-4周的分化属性，这对于需要肝部移植的患者来说，是一大福音。对由幼年牛软骨外植体组成的无血清培养基进行观察后发现，外植体的力学性能和生物含量得到了有效的加强，其性能一直比较稳定，细胞充满活力。含血清基外植体的力学则有所下降，并且损失了一定的聚糖并发。这充分说明了无血清培养基可以延长成熟细胞的特性，在组织互作无血清培养体系中，需要添加特定的材料来介导才能促进上皮间质的互作。
2.4 无血清培养基在肿瘤治疗方面的应用
无血清培养基具有许多优点，包括可以使细胞生存所需的营养物质得到保证，除掉了血清中的促分化剂，对于肿瘤的发现和治疗具有重要的应用价值。无血清培养可以增加SP2/0细胞中的瘤细胞，这些瘤细胞都具有干细胞特性，可以将SP2/0中的肿瘤干细胞进行富集。细胞外基质可以影响肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，无血清培养基中加入纤维连接蛋白后来培养人乳腺癌细胞，可以上调基质 金属蛋白酶的活性。单克隆抗体可以阻断整合素，可以抑制基质金属蛋白酶的活化反应。在进行肿瘤治疗时，对体外诱导扩增CIK细胞及抗肿瘤活性进行研究，分别采用无血清培养和含血清培养基，结果显示无血清培养基可以代替含血清培养基，某些方面还有含血清培养没有的优势。研究人员研究了适合于B16黑色毒瘤细胞培养的无血清培养基，对树突状细胞进行预防。这说明无血清培养的免疫活性细胞可以用于肿瘤的生物免疫治疗。
2.5 无血清培养基在外周血淋巴细胞抑制中的应用
抑制外周血淋巴细胞的无血清培养基是一种生物制剂，主要成分是凝集素、基础培养基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重组人胰岛素、柠檬酸铁和氨基酸母液，外周血淋巴细胞培养基不用动物或者人的血清，不仅降低了培养基成本，还可以降低疾病的传播，此淋巴细胞培养基可以增强淋巴细胞的转换率，促进淋巴细胞的分裂，抑制效果显著，可以广泛用于染色体核型的临床诊断，是康复率低的淋巴疾病的福音。
3 小结
无血清培养体系具有含血清培养体系无法达到的优势，但需要在培养通用性、生产高效性以及成本和安全方面进行改进，未来随着对细胞营养、细胞代谢 、细胞凋亡以及外源蛋白表达等的不断研究，采用更多的科学实验方法，可以使无血清培养基的开发更加快捷，使模拟细胞微环境的无血清培养体系可以广泛应用于生物科学领域，特别是再生医学领域，为更多的疑难杂症以及再生性疾病提供更多的服务。
参考文献
篇11
骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，可以在体外诱导分化出肝干细胞，此种骨髓源性肝干细胞可以为肝组织移植工程提供新的细胞来源。近年来的研究主要集中于体外诱导MSCs为肝干细胞，此种细胞具备了肝细胞的形态，在体外能够表现出一定的肝细胞功能〔1〕，但对骨髓源性肝干细胞在体内的定居和定位能力情况尚不明确。本实验通过对大鼠MSCs进行体外培养，诱导、分化出肝干细胞，同时建立暴发性大鼠肝衰竭模型，探讨骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。
1 材料与方法
1.1 材料
低糖DMEM培养基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝细胞生长因子（HGF)(CYTOALAB公司)、细胞培养箱(Forma公司)；纯系SD大鼠、3周龄、体重100～120 g(供体大鼠)和成年纯系SD雌性大鼠、体重180～220 g(受体大鼠)，由吉林大学实验动物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干细胞培养
1.2.1 MSCs分离、培养及定向肝干细胞的诱导分化
从供体SD大鼠股骨提取骨髓细胞。用比重1.073的Percoll分离液行MSCs分离，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培养和扩增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)诱导定向肝干细胞分化。
1.2.2 诱导后的骨髓源性肝干细胞鉴定
用ELASA法检测细胞培养液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫组化法检测细胞中细胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表达。
1.3 肝损伤动物模型的制作和分组
受体雌性SD大鼠20只，随机分为正常大鼠组和肝损伤组。肝损伤组用质量浓度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔内注射，剂量1 200 mg/kg体重。
1.4 同种异体大鼠骨髓源性肝干细胞移植
正常组大鼠和肝损伤组大鼠，分别以戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，常规消毒、备皮、铺无菌巾，上腹正中切口，长约1 cm，于肝中叶以BD胰岛素注射器注射肝干细胞悬液0.4 ml（107/ml )，观察无出血后缝合伤口。
1.5 受体体内移植骨髓源性肝干细胞鉴定
应用PCR技术检测性别决定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干细胞移植后1，2，4 w后取受体肝脏移植原位(注射部位)、邻位(距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测〔2〕性别决定因子基因片段(Sry)。引物按文献〔3〕设计，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物对SRY1/ SRY2扩增片段大小为317 bp，内引物对SRY3/SRY4扩增片段大小为121 bp。
2 结 果
2.1 骨髓源性肝干细胞的培养结果 大鼠MSCs经原代培养，细胞传代，诱导分化，细胞异形性较诱导前增加，表现为圆形、椭圆形细胞数量较诱导前明显增加，而梭形细胞数量减少，诱导培养10 d左右，细胞形态表现为圆形、椭圆形细胞为主，梭形细胞已极少见。免疫组化染色，二氨基联苯胺（DAB)显色，在倒置显微镜下，可见细胞形状显圆形或卵圆形，胞浆内出现棕黄色颗粒。CK18、CK19、Vimentin呈阳性表达。细胞培养液中AFP、ALB含量诱导前分别为(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；诱导后分别为(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。诱导后的AFP、ALB含量明显高于诱导前（P＜0.05)。表明经诱导的MSCs分化为肝干细胞。见图1。
2.2 肝损伤模型病理结果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝脏肝索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎性细胞浸润。见图2。
2.3 性别决定因子基因片段检测结果
肝损伤组：检测1 w时阴性，2 w时原位肝组织Sry阳性表达，邻位未表达，而4 w时原位及邻位组织检测到Sry表达，原位表达较2 w时增强，邻位较弱。正常肝脏组：1及2 w均未检测到表达，4 w时检测到原位微弱表达。见图3。
3 讨 论
MSCs具有多向分化潜能，特别是具有向肝脏干细胞、肝细胞及血管内皮细胞分化的潜能〔4〕，因而有望成为肝组织移植工程新的种子细胞来源。由于MSCs是成体干细胞，取材方便，可以来自患者自身，无排斥反应，故具有重要的临床应用价值。本实验根据文献报道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化为肝干细胞，对骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况进行初步研究。
目前研究表明移植肝干细胞可存活于受体许多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、肠系膜、肾及肾脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝脏由于其独特的营养环境、生理及解剖结构环境无疑是最理想的场所，可经门静脉输入或肝实质植入，该组实验采用肝脏植入方法，取得较好效果，说明此方法是安全可行的。本实验采用同种异体移植，应该考虑免疫排斥反应，但文献报道，纯化的MSCs具有独特的免疫原性，进行同种异体移植不需要预先应用免疫抑制剂，无免疫排斥反应，是良好的基因治疗靶细胞。
目前鉴定受体体内被移植后的肝干细胞有许多方法，其中较为常用的是以雄性动物为肝干细胞供体〔1〕，雌性动物接受细胞移植后，分化增殖的细胞 Y 染色体阳性，证明雌性受体内存活的细胞来自雄性供体细胞，这就可以清楚地将植入的细胞与原有的细胞区分开来，进一步研究移植作用，本实验采用雄性供体细胞为雌性受体移植，检测移植部位细胞的Y染色体表达情况，进而检测移植细胞是否定植。
实验结果显示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位检测到表达，4 w表达明显增强，而且临近部位出现表达；正常大鼠在移植后4 w移植原位出现微弱表达。实验证实，骨髓源性肝干细胞在正常大鼠肝脏及肝损伤大鼠肝脏内均能定居，但在肝损伤大鼠肝脏内定居能力明显增强。考虑可能为大鼠肝损伤后，刺激机体分泌出各种促进肝细胞再生的生长因子，为移植细胞提供定居所需的微环境。文献报道，在正常大鼠体内，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝损伤时，启动肝再生程序，这些因子才能被激活，引起肝细胞有丝分裂。
本文通过实验证实了大鼠骨髓源性肝干细胞移植后可以定居于受体肝脏内，而且在肝损伤后有利于干细胞移植的定居，这为下一步研究定居于肝内的骨髓源性肝干细胞的功能奠定了基础。
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篇12
2007年，科学家利用干细胞技术，在培养皿中成功地将皮肤细胞培养成诱导多功能干细胞，这种干细胞具备类似胚胎干细胞的功能，能够根据需要分化成不同的细胞。早期的神经细胞培育正是在这种迂回技术下实现的，但是由于这种技术诱导多功能干细胞不仅转化时间过长、程序繁杂，而且容易引发癌症等风险，所以未能成为成熟的技术。
2010年，科学家绕开了诱导多功能干细胞的繁杂步骤，成功将实验鼠的皮肤细胞直接转化成神经细胞，并在此基础上，成功将人体皮肤细胞直接转化成神经细胞。
培养神经细胞的新技术
篇13
关键词 毛发；移植；研究
[中图分类号]R737.33[文献标识码]A[文章编号]1674-0742（2015）04（a）-0189-02
[作者简介]周洪星（1974-），男，四川成都人，大专，主治医师，研究方向：致力于FUE-AHT-NFS体系毛发移植技术的临床研究与应用。
自19世纪20年代开始对毛发移植技术进行研究以来，毛发外科移植技术的发展就方兴未艾，其中已经应用的主要有秃发头皮缩减外科、头皮自体移植技术以及毛囊单位的移植技术等。在西方国家，因为近代科技的发展其毛发移植技术相对国内来说更加先进，自体毛发移植技术经过过去上百年的摸索以及发展，移植之后毛发的成活率已经得到了显著的提升且形态更加接近自然美。
现今，在临床上所采用的毛发移植技术多样，各方面的技术手段都有。该文就多年毛发移植行业的经验对其发展的现状以及进展等前景做一个综述。
1 新型毛发移植技术临床应用
1.1 毛发移植基础理论
在整形行业内，大多数学者还是认为“供区优势理论”是毛发移植之后所产生的生物学行为最为主要的。也就是在移植之后毛发仍然具有在供区上生长的特性，并且能够在受区之内长时间存在。患者在进行毛发移植以后，其移植部位的微生态环境可能会因为雄性激素的水平不同而发生改变。大量数据研究表明，毛囊干细胞不仅仅只在毛囊的周期生长之中有着重要的作用，也是表皮进行自我修复和更新的基本来源[1]，这一理论就是现代外科毛发移植技术成功的基础。
现展的毛发移植手术最重要的进展就是从供区进行切取，然后制备毛发的皮片并植入受区内微小的移植技术。“微型毛胚”一般包含有1~2根毛发；“小型的毛胚”包含有3~4根毛发，大多数条型毛胚以及方型毛胚等均属这一类型。直径2~4mm毛胚被称为标准性毛胚，普遍含有7～8根毛发。
1.2 毛发自体移植技术
1.2.1 毛囊单位移植技术和立体显微镜的应用 采用十倍双目放大镜从全厚的头皮上自然切取所获得的成簇毛囊平均存在1~4根毛发/每簇，然后再借助手术刀将标准成簇毛囊植入到秃发区内的针孔，也可以将毛囊簇及周围存在的皮肤植入到头皮之上所切的缝隙之内。毛囊单位移植技术的优势就在于能够得到较高毛发的密集程度，一次手术可有使得每平方厘米植入大于60根毛发。其短处就是手术以及护理所需要花费的时间很长。这项研究技术倡导者认为，这项技术相比于非显微镜移植的毛发损伤比例至少小于20%，但是研究显示毛囊的横断面以及毛球的切除不会像想象中那么重要。只要毛囊还存在着干细胞，毛发就能够再次生长[2]。这就是争论的核心观点。大量研究已经证实，采用显微镜能够少用20%的供区皮。当供选择的区域无法足量的时候，就必须首选显微镜制备。
1.2.2 超密度植发 现今在临床上已经有医生倾向于进行一次手术移植大于一千个以上的微小毛发皮片段，这就是所谓的“超密度植发”，进行“超密度植发”能够使得移植结果更为迅速且效果更为优良。不过这种方式有潜在的医学问题：就是在临床上，每次手术都要移植超过600束，而移植600束的时间大约为4h，移植到1200束则需要6h，这对于医生和患者来说都是一个极其漫长而难熬的过程，医生能否坚持那么久而不疲劳，患者是否能够耐受住手术的长时间。如果患者的受区面积较大，或者其头皮较为肿胀，移植物就可能会出现压迫进而影响到毛发生长，供区的头发有一定的概率被全部取完。所以对于毛发移植手术来说，手术的方式以及手术的对象就显得极为重要，而且在临床上还是要考虑留有足够的供区头发以作为备用。在临床上采用超密度植发的时候需要进行技术评估，这种方案能实现更好的治疗效果，但是会存在手术过程漫长等缺点。
2 组织以及基因工程在毛发移植技术方面的应用
组织工程以及基因工程对于毛发移植方面主要能够弥补患者供区面积不足，也能够最大限度地去减少患者的痛苦，实现毛发移植的微创，也能够培养出和受体兼容性更佳的供选择毛发。
2.1 毛囊的体外培养与原位细胞培养
现今存在于毛发自体移植中，矛盾实际上就是毛发需求量大而供区毛发量小。这就表明通过组织工程学进行体外毛囊细胞扩增就能够解决这个矛盾，而且离体对毛囊进行培养也对弄清毛囊生长以及成熟的各方面影响因素有莫大的帮助。现今对于人类毛囊的体外培养技术也已经在技术上取得成功，不过还是其应用到临床还需要更多的工作去完善。也有学者提出了“克隆疗法”的概念，这种疗法在本质上来说其实也就是一种自体细胞增殖技术[3]。这个方法跟体外克隆是一个道理，就是在患者身上取小块带毛发的头皮，对毛囊干细胞进行分离然后培养增殖，在所培植的细胞数量达到一定级数后，再将增殖的皮毛进行秃发区的移植，这种技术手段现今已经通过动物实验得到了验证并取得成功。不久的将来就可能会应用到人体。这当中可能会用到特制原位细胞培养基（CCM），这种培养基就是把胰岛素以及生长激素等加入到培养基之中制成凝胶，能够用来外用。原位细胞培养基主要作用就是加快毛发的生长并抑制毛发掉落，其机制就是通过刺激上皮再生功能。美国学者Lindenbaum等对以原位细胞培养基治疗的脱毛患者进行了随机双盲研究[4]，时间长为6个月，显示以原位细胞培养基1~3mL，然后封包3个小时进行治疗，发现治疗组患者的平均毛发生长较正常组更优，数据比较两组存在明显差异（P<0.05）
2.2 2脂质体毛囊传递系统与基因治疗
法国学者多马申科等在免疫缺陷小鼠身上植入人类的皮肤，在移植物表明应用Lipo plex[5-6]。其研究结果表明，在超过两千四百个毛囊为研究对象中发生转染的细胞只是毛囊干细胞，并且在Lipo-plex之前对移植物进行拔毛处理以增加转染比例。这个试验研究表明毛发生长的初期，采用Lipo-plex可以达到基因选择性表达到干细胞中并且发生转染，进而影响到毛发自身的生长特性。这个试验证明的结论对于改变毛囊表型并实现基因治疗毛发疾病理论有着极大的影响，打下了较为可信的基础研究。在现今，秃发基因也已经被科学家所发现，这个基因有助于对人类毛发再生机制进行研究，并开发出治疗秃发的新途径。
3 结语
在此还值得一提的是就是法国一家从事生物技术的公司最新研发了Calviron头发种植系统，这个系统拥有着许多优势[7-9]，其优点表现在：毛发获取的周期短，在手术室采用刀片组对一直发片进行移植，最多时能够在一次手术取5条发片。然后将发片置于自动分割器之中，一次性压取得到超过500个移植的发片。如果头皮条自身的长度超过了10英寸，则采用多次压取技术就能够得到规格都较为均一的微小发片，其最大的缺点就是对毛囊没有精准的识别功能，这会极大地增加手术对毛囊的破坏作用，并且在手术前必须进行特殊的培训，手术所用工具为钻孔手机，能够实现快速钻孔。并且控制极为方便，能使得孔径密度以及大小相互一致。熟练的操作人员能够在不到15 min打孔到500个。到现在已经存在第二代产品“Omnigraft头发种植系统”，其设备的治疗效果更为显著。
在现今，较为主流的毛发移植技术还是以患者自身存在充分供毛区域为前提的。这就使得对那些需要移植的面积大或者毛发完全缺失的患者来说，这种主流毛发移植技术就很难展开了。这些治疗方法本身都产生新毛发区域，也无法达到增加毛发数量的目的。因此，供区毛发资源缺失的问题就极为明显了。这个矛盾已经是现今毛发移植领域极难解决的问题。许多学者针对这些问题进行多方面研究和考证，在假发的移植领域，易斌等采用聚丙烯材料顶端固定假发移植进行试验，为临床的最终应用打了良好的基础。Agrawals在临床上对治疗失败的10名男性脱发患者进行共聚多酰胺纤维治疗[10-11]，每个人采用1000根纤维，然后在手术后3年时间内进行随访，随访的患者每年毛发的掉脱比例低于20%。也有使用尼龙材质来作为供发的报导，不过这种方式极其容易导致患者出现感染以及排异，导致其在临床上极少使用，随着现代材料学大力发展，这中方法依然被广泛关注，也是现阶段较为有效的一个研究热点。异体移植的手段现在也是一种被认可的治疗方式。异体之间的毛囊移植也被强烈关注。Reynolds等就成功把毛囊的球部进行同种异体移植技术，这个技术在最后发现不会出现异体免疫的排斥作用。现在大量的研究证据已经证明了啮齿目动物的毛囊间都会存在或多或少的免疫逃逸。这使得异体毛囊移植技术在临床上具有较好的前景。
伴随着现阶段基因以及组织工程技术方面的大力发展，许多国内外的专家已经提出毛发干细胞筛选[12]。对人类的毛囊体外培养获得了巨大成功。不过现今毛囊的离体培养技术还是有着亟待解决的瓶颈，临床应用还十分的遥远。原位干细胞培养已经在创伤修复研究中取得了成功。徐荣祥等认为斑秃病患者的毛囊干细胞发生萎缩，重启毛囊干细胞的复活就成为毛发再生的技术核心。许多研究也已经证实，毛囊干细胞能够实现直接下移，或者直接在毛囊的干细胞地方生长出新的毛囊，湿润技术实际上就是培植毛囊，促进局部微循环的改善。最终生长出正常的毛发。徐荣祥发现采用湿润技术能够实现皮肤的再生愈合，最终发现成年皮肤干细胞原位培养对于毛发治疗方面有着较大潜力。这一结论能够为后面的研究者带来更好的启示，皮肤或者毛囊的干细胞工程学的研究也最终必然会为毛发移植领域带来长远的意义。不过相比于现今较为成熟的自体移植以及高密度植发技术而言，来自基因工程和组织工程方面的技术手段来相对不成熟，大多数试验还停留在实验室的研究阶段，即使偶见有临床报导那也是极少的个例，在临床上大范围应用还有相当长的路要走。
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