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篇1
主办单位：中国农业科学院茶叶研究所;中国农业科学院生物技术研究所
出版周期：月刊
出版地址：浙江省杭州市
语
种：中文
开
本：大16开
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发行范围：国内外统一发行
创刊时间：2011
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篇2
一、生物技术在粮食生产中的应用
生物技术在粮食生产中的应用主要有以下几个方面：可以利用转基因技术获得产量更高，并有一定的抵御虫害的作物品种，获得营养价值更高的作物品种，此外，还可以利用细胞工程技术对植物进行无性繁殖，从而获得高产量的作物，利用生物技术可以制造出无毒生物农药从生产出更多的绿色产品。生物技术培育出的作物主要有三代，第一代是通过培育转基因作物可以提高农作物抗虫害的能力，目前种植面积比较多的是抗除草剂的农作物。第二代是通过转基因来提高农作物的营养价值为主要特征。第三代是通过转基因作物提高食品的免疫功能，即可以利用转基因的作物来生产一些具有新功能的食品以及药物。
二、生物技术在粮油加工中的应用
我国的粮油加工产品主要以初级产品为主，而在食品的精深加工方面比较落后，资源的深层次利用率比较低，而利用生物技术可以将产品原料加工成产品并实现产业化，通过对农产品的二次开发以此形成新的产品。利用生物技术可以快速的提高粮油加工的能力并提升水平，使我国的粮油加工生产能力能够得到跨越式的发展。
三、生物技术在食品加工中的应用
生物技术已经渗透到了食品加工的各个方面，利用基因工程可以有效的改良发酵工业中的微生物菌种，对食品加工原料进行改造，提高氨基酸在食品加工中的含量，此外，利用基因工程还可以改进其生产工艺，进一步提高食品的营养价值。利用蛋白质工程可以创造出人类需求的不同功能的蛋白质新产品，可以更改酶的特性。在食品工程中酶技术的应用比较成熟，在粮油食品加工中应用比较广泛的是酶制剂的应用，主要有酿造酶、蛋白酶、果品酶等。这些酶主要应用在果蔬加工，乳制品加工等方面。
四、生物技术与食品安全
生物技术在食品安全中的应用主要是转基因食品安全问题。任何物种在进化过程中都会经历自然选择或者是人工选择，他们能够幸存的物种都是这两种选择的结果，不过是自然选择还是人工选择其实质都是遗传变异选择，在物种进化中遗传是基础，变异一定会存在。任何物种都是在遗传的基础上经过进化发展而来的，对遗传变异进行人工选择就是常规育种，而转基因育种在本质上和常规育种并没有本质的区别，转基因的食品安全问题和其它新出现的技术一样，只是在人类科学进步进程中新出现的科学问题而已，应该对以抱有正确的态度，深入的对其进行研究和探讨。转基因技术作为发展最快的新技术，正对人们生活的各个方面产生巨大的影响。
五、生物技术与食品安全检测
食品安全越来越受到人们的关注，日常食品安全已成为人们生活的焦点，为了让人们吃到更为安全的食品，对食品安全检测技术的研究已经提上日程，而生物技术在食品安全检测中的应用，发挥了较大的推动作用，并取得了不错的效果。在当前的食品安全检测中比较广泛应用的生物技术有生物芯片、免疫技术等生物技术，通过这些生物技术的应用使得食品安全的检测更加方便快捷而且灵敏度也比较高，人们对食品安全也更加放心。
六、粮油深加工生物技术的进展
在粮油深加工方面，美国主要利用酶以及发酵工程来进行粮油资源的开发，同时还利用基因工程等生物技术来改良农作物的性能，改善农作物所含的营养价值。生物技术在粮油加工中的应用主要有以下几个方面，首先是利用生物技术进一步提高农作物的产量，并为农作物的生产寻找更好地的农业技术。通过新的生物技术的应用进一步改良农作物的品种，另外，还有利用农作物、农业废弃物和加工副产物生产工业制品，包括生物能源、生物材料等。
七、结语
生物技术在食品粮油领域，在食品生产、粮油食品加工以及副产品利用等方面都有重要的应用，随着基因组技术在农作物的成功实施以及深入开展，新一轮的农业技术革命将会展开。为此，要认识在粮油食品安全领域生物技术应用的重要性，并不断在粮油食品加工中引入生物技术，以更好的促进粮油食品加工行业的发展。
篇3
环境生物技术已不单纯是一种污染治理技术，而已开始影响到包括其他行业的产业政策，促进各工业部门逐步以生物过程替代传统的化工过程，如利用生物酶制剂在造纸行业中，进行生物漂白，减少甚至彻底替代化学漂白，并最终在造纸工业中实现完全的生物制浆和生物漂白，彻底解决严重污染我国水环境的造纸黑液问题，使许多污染行业的工业生产真正进入无污染的清洁生产的轨道。
1 环境生物技术的特点
生物是构成生态系统的要素，生态系统内物质循环主要是依靠生物过程来完成的。科技的发展也充分证明生物技术是环境保护的理想武器，这一技术在解决环境问题过程中所显示的独特功能和显著优越性充分体现在它是一个纯生态过程，从根本上体现了可持续发展的战略思想。生物技术在处理环境污染物方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点，加之其技术开发所预示的广阔的市场前景，受到了各国政府、科技工作者和企业家的高度重视。
目前生物技术应用于环境保护中主要是利用微生物，少部分利用植物作为环境污染控制的生物。生物技术已是环境保护中应用最广的、最为重要的单项技术，其在水污染控制、大气污染治理、有毒有害物质的降解、清洁可再生能源的开发、废物资源化、环境监测、污染环境的修复和污染严重的工业企业的清洁生产等环境保护的各个方面，发挥着极为重要的作用。应用环境生物技术处理污染物时，最终产物大都是无毒无害的、稳定的物质，如二氧化碳、水和氮气。利用生物方法处理污染物通常能一步到位，避免了污染物的多次转移，因此它是一种消除污染安全而彻底的方法。大部分有机污染物适于作为底物，一些有机污染物经生物过程处理后可转化成沼气、酒精、生物蛋白等有用物质，因此，生物处理方法也常是有机废物资源化的首选技术。生物过程是以酶促反应为基础的，酶是一种活性蛋白，生物反应过程通常是在常温、常压下进行的，因而投资省、费用少、消耗低、效果好、过程稳定、操作简便，同时，它还可和其他技术结合使用。生物过程代替化学过程可以降低生产活动的污染水平，有利于实现工艺过程生态化或无废生产，真正实现清洁生产的目标。另外，生物技术的产品或副产品基本上都是可以较快生物降解的，且都可以作为一种营养源加以利用。用生物制品代替一切可以取代的化学药物、化石能源、人工合成物等，有助于把人类活动产生的环境污染降至最低程度，使经济发展进入可持续发展的轨道。利用环境生物技术可治理用其他方法难以处理的环境介质，即用生物修复技术净化环境，使受污染的宝贵资源如水资源、土壤等得以重新利用，同时还可进一步强化环境的自净能力。
2 环境生物技术的重要进展
环境污染不但影响了国民经济的可持续发展，甚至已威胁到人类的健康、智力乃至生存，因此全球各国近几年都在寻找新的途径和方法，以治理和解决环境污染问题。我国是一个发展中国家，经济水平和科技总体水平离国际发展水平仍有相当差距，这就要求我国在科技发展特别是环保高科技发展上，需跟踪国际前沿，与国际同步开发未来可能应用的高新技术。以下介绍几项已接近产业化的环境生物技术。
2.1 高硫煤微生物脱硫技术
我国是一个发展中国家，开发廉价的、操作简便的煤脱硫技术，将具有深远的经济和环境保护意义。与现有的物理、化学法相比，微生物洁净技术具有投资低、操作简便、反应条件温和、不产生新污染，并可和现有的物理洗煤过程相结合，脱除其中的灰分，而煤基本无损失，且可提高煤的燃值等优势。
煤的微生物洁净技术主要是脱硫、脱尘。煤炭中的硫分主要包括有机硫和无机硫、无机黄铁矿硫以及少量的硫酸盐硫。其中，有机硫分、黄铁矿硫FeS2较易去除，早期的研究主要利用一些自养菌在几天时间里将黄铁矿氧化分解成铁离子和硫酸，硫酸溶于水中而排出。虽然该方法脱硫效率较高，可去除90%的无机硫，使某些煤的含硫量降至1%以下，但处理的时间较长，并要求较大的反应器容积和较细的煤炭粒径。
为提高脱硫效率，近年来研究人员把选煤技术之一的浮选法和微生物处理相结合，即把煤粉碎成微粒与水混合，并将微生物加入溶液中，让微生物附着在黄铁矿表面，使其表面变成亲水性，能溶于水。在浮选中其难以附着在气泡上，下沉至底部，从而把煤和黄铁矿分开。由于它仅处理黄铁矿的表面，因此脱硫时间只需数分钟即可，从而大幅度缩短了处理时间，可脱除无机硫约70%。另外，该法在把煤中的黄铁矿脱硫时，灰分也可同时沉底，所以也具有脱去灰分的优点。目前，浮选法微生物脱硫已成为国际上洁净煤技术开发的热点。
2.2 造纸工业生物制浆和生物漂白技术
造纸工业中的制浆和漂白工序是污染物产生的主要工序。与化学法相比，虽然机械法制浆纸浆得率高，可节省大量林木资源，但能耗很大，成品纸强度等质量性能不如硫酸盐浆，因而限制了这项技术的发展。生物技术可以帮助解决这问题，其中以生物制浆与生物漂白为最具优势，采用生物制浆与生物漂白可以有效减少蒸煮黑液和漂白废液的产生。利用微生物与微生物酶类进行生物制浆与生物漂白具有很大的优势和潜力，因为微生物极易生长繁殖，酶催化反应具有高度专一性，反应条件温和，并且高效无污染。
木质素是造纸工业中有效利用纤维素的最大障碍。传统的化学漂白法是采用多段的氯/二氧化氯漂白及碱提取来去掉木质素，在废水中会有大量含氯的、致癌致畸的物质，如呋喃、二恶英等，造成严重的环境污染和生态破坏。将生物预漂白技术引入制浆造纸工业中，用木聚糖酶对纸浆进行预漂白，至今，用于生物预漂白的木聚糖酶已经经历了三代的发展。目前，对第三代木聚糖酶的研究与应用正进入高峰期，采用基因工程与蛋白质工程手段获得性质优良的耐热耐碱木聚糖酶已成为各相关实验室的研究热点，期望不久的将来重组酶会更有效地应用于漂白工艺中。未来生物制浆和生物漂白的技术突破将使造纸工业摆脱污染，实现清洁生产。
2.3 污染土壤的生物修复
人类的生产活动，当代工业的迅速发展，大量的人造化学物质排放入环境中，对资源和环境构成越来越严重的破坏。化石燃料的开采和使用，工业三废的排放，给我们赖以生存的环境造成难以估量的污染，不仅制约了经济的发展，而且影响到人类的健康和生存。
针对严重污染的土壤，我国尚未采取大规模的治理措施，仅在少数地区开展了治理，并以物理化学方法(如洗脱、吸附)为主，不仅投资成本高，而且也造成了二次污染。对全国范围的污染环境进行修复，若采用传统方法，即使考虑劳动力相对便宜的因素，其投资规模将仍然非常庞大，如采用生物修复技术，不仅其投资规模大为缩小，而且还没有二次污染。综上所述，环境污染的生物修复技术是我国今后治理环境污染必须发展的生物技术，更具有广阔的市场和发展前景。可预见，在21世纪，生物修复技术将成为我国生态环境保护领域最具有价值和最具有生命力的大面积污染的优选生物工程技术。
生物修复技术是80年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，其主要利用生物特有的分解有毒有害物质的能力，去除污染环境如土壤中的污染物，达到清除环境污染的目的。实践结果表明生物修复技术是可行的、有效的和优越的，此后该技术被不断扩大应用于环境中其他污染类型的治理。生物修复是采用诸如提高通气效率、补充营养，投加优良菌种、改善环境条件等办法来提高微生物的代谢作用和降解活性水平，以促进对污染物的降解速度，从而达到治理污染环境的目的。
结束语
目前，我国的环境生物技术处于刚刚起步阶段，该技术的进一步开发需要得到社会、同行及主管部门的广泛支持，大力开展以污染控制生物技术为主体的环境生物技术的研究，将大力推进生物技术在环境保护中的应用，并将通过生物高技术的发展带动整个环保科技的发展，解决我国目前和未来面临的严峻的环境保护问题，并为环保市场提供高品质的环境保护高技术，应该充分认识到环境生物技术开发对我国环境保护和社会、经济发展的重大意义。
篇4
1.1基因工程在农业领域的应用
基因工程即利用分子生物学和微生物学技术，设计好不同来源的基因顺序，在体外成功构建杂交DNA分子后导入受体细胞，使受体细胞表现出人们需要的表现型，产生出人们需要的物质。在农业领域应用基因工程技术，获得的农作物优质、高产、抗性强，还可获得畜、禽新品种及具有特殊作用的动、植物。例如，经过7年的努力攻关，2011年胜利突破了大面积示范（即6.67hm2示范）平均产量为13500kg/hm2的超级杂交稻第3期目标，达到了13899kg/hm2[1]；运用转基因技术将相应的基因导入油菜中有望培育出转基因抗病油菜新品种[2]；运用基因工程技术可将抗除草剂基因导入农作物中，使农作物能够不受除草剂的影响，目前已生产出多种抗除草剂作物品种，应用广泛[3]。
1.2细胞工程在农业领域的应用
细胞工程是指在体外培养细胞，以改变细胞某些生物学特性为目的将不同作物或动物进行细胞杂交，使植物或动物个体繁殖速度加快，以获得优良品种或新品种及某些具有特殊作用的物质的一门技术[4]。细胞工程技术在植物快速繁殖、植物新品种选育等方面发挥着重要作用。目前植物体细胞杂交应用较多，如可以将马铃薯细胞和番茄细胞进行杂交，可获得上结番茄下结马铃薯的“番茄马铃薯”；将豆科植物与向日葵进行细胞杂交，可培育出具有高营养价值的“向日豆”[5]。
1.3发酵工程在农业领域的应用
发酵工程即利用微生物具有的特殊作用生产出对人类生产有用的产品，或直接将微生物应用到工业生产过程的一门新的技术。发酵工程主要可应用在农业领域的2个方面，一是生产传统的发酵产品，如果酒、茯砖茶、食醋等；二是生产一些食品添加剂。如茯砖茶的制作过程中就运用到了发酵工程技术，通过调控渥堆时间、使用接种剂、发酵剂等方法可以改进茯砖茶的加工工艺，进而可生产出“金花”饱满、品质优良的茯砖茶。
1.4酶工程在农业领域的应用
酶工程，简单来说就是利用酶的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质。酶工程可应用在农业领域中的制酒、制酱等方面。例如，随着我国粮食的不断增产，一些地区出现了粗粮过剩的问题，需要解决粗粮的淀粉利用。解决办法之一是生产葡萄糖，但由于葡萄糖甜度不大，难以在市场上应用。最有效的办法还是运用酶工程技术的手段，将葡萄糖转变为甜度大的果糖，果糖不仅比葡萄糖甜度大，其比蔗糖的甜度还高50%以上。
2微生物肥料在农业领域的应用
2.1微生物肥料的特点
微生物肥料是含有活的微生物的特殊的肥料，在农业生产中应用该种肥料可获得特定的肥料效应[6]。生物肥料的定义分为2个方面，从狭义上讲，生物肥料就是指微生物肥料，是由具有特殊作用的大量有益微生物发酵产生的，活性高。施入该种肥料能够产生活性物质，能够增加作物的固氮作用，改善土壤的理化性质，使作物的生长环境变得更好，使作物生长更优、产量更高。从广义上讲，生物肥料泛指各种具有特定肥效的生物制剂，包括特定的活的生物体、生物体的代谢物或基质的转化物等，此种生物体不限定，既可以是微生物，也可以是动、植物组织和细胞[7-8]。
2.2生物肥料的应用优势
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（一）概述
生物处理技术处理含油废水指的是利用在微生物代谢作用下，将分散到水中的原油、有机污染物进行降解处理，使有机污染物质转化为稳定的无害物质，最终完全无机化。近来较普遍应用且相对成熟的生物处理工艺包括好氧生物处理技术和厌氧生物处理技术两大类。顾名思义，所谓好氧生物处理技术，是指利用好氧微生物代谢作用处理含油废水的技术，按所选材料，分为活性污泥法、SBR法、生物膜法、氧化塘法、AB处理法等形式；而厌氧生物处理技术，则是利用厌氧微生物作用进行含油废水处理的技术，按处理设备，分为厌氧接触法、厌氧生物滤池、升流式厌氧污泥床（UASB）、厌氧生物转盘等处理方法。这两类生物处理技术在有机物负荷、污泥产率，能耗、营养物需要量、应用范围，对水温适应性、启动时间以及处理效果各方面作用不同，相对来说，好氧生物技术在处理效果上较厌氧处理技术好，但两者各有其优缺点，单纯采用一种技术难以达到理想效果。因此，结合使用两种处理技术进行含有废水处理变得较为普遍，遵照分级处理程序，先采用厌氧技术进行初步处理，利用好氧工艺进行处理检验和再处理，以确定合理的技术过程。
（二）实例
学者对含油废水处理技术的综合研究表明，油田污水的处理方法很多，如物理法、化学法等，这两种方法都能够获得一定的处理效果，但存在较多劣势，前者成本高，后者由于投入了化学药剂极易产生二次污染。相比之下，生物处理技术的经济性、适用性最强，对于大规模污水处理收到较好效果。在国内许多油田得到应用，以下对应用该技术的油田及其废水处理工艺作基本介绍：1.胜利油田王家岗废水处理站，该站点建成投产于2002年，利用美国公司菌种，由油田自行设计完成占废水总量约为70%的含油废水处理工程。其技术处理过程为：含油废水—接收罐—两级大罐沉降—溶气浮选—混合池—接触氧化池—沉淀池—计量排放。该站经过生物处理技术的废水指标满足国家废水排放标准。2.大港油田东二废水处理站，该站用美国公司RBC菌种，借助容积为2700m3的接触氧化池每天处理上万立方的废水。其废水处理技术过程为：两级沉降—过滤—隔油—接触氧化池—缓冲池—氧化塘—排放。经处理后的废水符合国家要求排放标准。3.冀东油田高一联废水处理站；该站同样建成并投产于2002年，该工程采用石油大学技术每天实际处理的废水量约3600m3，仅小于设计处理能力400m3，其废水处理技术过程为：两级大罐沉降—过滤—缓冲罐—泵提升—冷却塔—均质池—厌氧池—中沉池—接触氧化池—二沉池—缓冲池—提升—排放。对外排水质的验收报告平均数据进行处理，表明废水排放符合国家标准。
二、含油废水生物处理技术方法
随着油田开采力度加大，采油技术也在不断发展，前后经历了天然能量动力、人工注水方式、改变注入水特性这三次采油变化。目前较普遍采用以人工注水方式保持地层压力，以及通过改变注入水的特性提高采油率的后两种采油方式。由于经电脱水、分离出来的“油田污水”成分复杂，除含原油以外，还溶有各种有害杂质，因此，选取生物处理技术对废水进行处理，方法有：1.曝气生物滤池组合工艺法，该方法是在微生物氧化分解作用，填料及生物膜的吸附阻留作用和食物链分级捕食作用以及反硝化作用下共同完成的。相比传统的活性污泥法，具有生物浓度、有机负荷高，占地面积小，过程简单，成本投入低，抗温性好，菌群组成合理，耐冲击性等优点。包括：1）膜生物反应器—曝气生物滤池法，它能够高效快速过滤超滤膜，同时有效降解高浓度活性污泥生物，且不借助二沉池和污泥回流系统，具有成本小、能耗低以及处理效果好等优点。2）超声气浮—BAF法，在羟基自由基氧化、气泡内高温热解和超临界水氧化三种因素作用下，利用声化学这一边缘科学，在大于20Hz的超声波条件下，提高化学反应速率，超声波有促进有机污染物降解和提高废水的可生化性的功能，但单独应用时去除废水中有毒物质的能力不高。3）A/O—BAF法，此方法模式是“隔油/气浮/二级生化”，处理效果不甚理想。2.氧化沟，氧化沟是在20世纪中期由荷兰开发的一种污水处理工艺，它是在传统活性污泥法的基础上进行改造生成的，污水和活性污泥的混合液可在沟渠形的曝气池中循环流动。其技术过程简单，处理效果良好，排放水达标。3.人工湿地，该方法处理污水最初是借助芦苇之类的人工湿地净化污水，去除其中大量有机和无机物。经过发展，演变为利用基质、微生物和植物，在生态系统的物理、化学和生物协调作用下，通过过滤、吸附、吸收和分解等一些列过程来净化废水，实现废水无害化处理目标。同时通过生物地球化学循环，有利于绿色植物生长。它在出水水质、营养物质去除能力、成本费用、技术含量、综合管理方便等方面具有明显优势。4.氧化塘，将各类微生物和藻类置于氧化塘中，发生氧化反应后，去除有机污染物，使其转变为无机物。研究表明，它对油、酚类有机物、硫化物等的去除效果都较好。5.特种菌类处理，在污水生物处理中，很多细菌具有特殊功能，这些菌类经过分离、培养后，对有机物处理有良好效果。
三、生物处理技术的主要问题及趋势
目前采用高效降解菌的生物深度处理技术在含油废水深度处理领域的研究已取得很大进展，但未来发展中仍存在以下问题，需要重视。体现在：1.由于含油废水所含有机物复杂、繁多的特性，需要结合各种方法，优化各步处理技术，再找出一套综合工艺，满足深度处理技术高效处理废水的要求。2.提高含油废水深度处理器殊菌的浓度与活性。在了解含油废水成分组成的基础上，分离、培养各筛选优势菌种，监测该菌的最佳降解条件。根据反馈信息，提高净化效率。3.基于生物工程技术的处理效果，创新技术。提高更有效处理含油废水的可能性。
国外处理采油废水的技术已经由单一利用一种方法转变为多种方法结合使用，出现了物理化学方法与生物技术综合运用，提高了废水处理效率和达标度。而国内多利用二次、三次采油工艺处理废水，相对较落后，不能达到理想的处理效果，为对油田中这种难降解含油废水进行处理，生物深度处理技术成为国内油田采油废水处理技术的发展趋势。
参考文献
篇6
目前，用于土壤重金属污染治理的方法包括物理修复、化学修复和生物修复。物理修复、化学修复虽能达到一定的效果，但是能耗大、二次污染等问题也限制了其应用[1]，尤其对于大面积有害的低浓度重金属污染，更是难以处理。重金属污染土壤的原位生物修复是利用各种天然生物过程而发展起来的一种现场处理土壤环境污染的技术，可利用生物削减土壤中重金属含量或降低重金属毒性[2]。根据修复主体的不同，它主要分为微生物修复、植物修复和植物-微生物联合修复。微生物修复较物理修复、化学修复有着无可比拟的优越性，操作简单、处理费用低、效果好，对环境不会造成二次污染，可以就地进行处理等，具有很大的潜力和广阔的应用前景。
1.微生物修复机理
重金属对人的毒性作用常与它的存在状态有密切的关系。一般地说，金属存在形式不同，其毒性作用也不同。微生物不能降解和破坏重金属，但可以对土壤中的重金属进行固定、移动或转化，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的。
1.1 微生物的转化作用
微生物对重金属的转化作用包括氧化还原作用、甲基化与去甲基化作用以及重金属的溶解和有机络合配位降解。土壤中的一些重金属元素可以多种价态和形态存在，不同价态和形态的溶解性和毒性不同，可通过微生物的氧化还原作用和去甲基化作用改变其价态和形态，从而改变其毒性和移动性。
1.1.1 氧化还原作用
微生物可通过改变重金属的氧化还原状态，使重金属化合价发生变化，改变重金属的稳定性。Silver等[3]提出，在细菌作用下氧化还原是最有希望的有毒废物生物修复系统。微生物能氧化土壤中多种重金属元素，某些自养细菌如硫-铁杆菌类 （Thiobacillus ferrobacillus）能氧化As、Cu、Mo和Fe等，假单孢杆菌属 （Pseudomonas）能使As、Fe和Mn等发生生物氧化，降低这些重金属元素的活性。微生物对重金属的转化作用常见的有对铬、汞、硒和砷等的转化。如假单胞菌（ Pseudomonadsp.） 可以把六价铬还原为三价铬，从而降低其毒性[4]。
1.1.2 甲基化与去甲基化作用
微生物可通过改变重金属的甲基化和去甲基化作用改变重金属的环境效应。Fwukowa从土壤中得到假单胞杆菌K-62，它能分解无机汞和有机汞而形成元素汞，元素汞的生物毒性比无机汞和有机汞低得多。Frankenber等通过耕作、优化管理、施加添加剂等来加速硒的原位生物甲基化，使其挥发而降低硒的毒性，此生物技术已在美国西部灌溉农业中用于清除硒污染[5]。有些真菌和细菌能使无机As转化为挥发性有机As，从而降低其毒性[6]。
1.1.3 重金属溶解或配位络合作用
一些微生物，如动胶菌、蓝细菌、硫酸盐还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的阴离子基团，与重金属离子形成络合物。如Bargagli在Hg矿附近土壤中分离得到很多高级真菌，一些菌根种和所有腐殖质分解菌都能积累Hg达到100 mg/kg土壤干重[7]。
1.2 微生物的积累和吸着作用
土壤中重金属离子有5种形态：可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残渣态。前3种形态稳定性差，后2种形态稳定性强。重金属污染物的危害主要来自前3种不稳定的重金属形态[6]。微生物固定作用可将重金属离子转化为后两种形态或积累在微生物体内，从而使土壤中重金属的浓度降低或毒性减小。微生物固定作用有胞外吸附作用、胞外沉淀作用和胞内积累作用3种形式。其作用方式有以下几种：①金属磷酸盐、金属硫化物沉淀；②细菌胞外多聚体；③金属硫蛋白、植物螯合肽和其他金属结合蛋白；④铁载体；⑤真菌来源物质及其分泌物对重金属的去除[8]。
1.2.1 胞外吸附作用
胞外吸附作用主要是指重金属离子与微生物的产物或细胞壁表面的一些基团通过络合、螯合、离子交换、静电吸附、共价吸附等作用中的一种或几种相结合的过程[2]。许多研究表明细菌及其代谢产物对溶解态的金属离子有很强的络合能力，这主要因为细菌表面有独特的化学组成。细胞壁带有负电荷而使整个细菌表面带负电荷，而细菌的产物或细胞壁表面的一些基团如-COOH、-NH2、-SH、-OH等阴离子可以增加金属离子的络合作用[9]。研究表明，许多微生物，包括细菌、真菌和藻类可以生物积累（bioaccumulation）和生物吸着 （biosorption）环境中多种重金属和核素[10]。一些微生物如动胶菌、蓝细菌、硫酸盐还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的阴离子基团，与重金属离子形成络合物。
1.2.2 胞外沉淀作用
胞外沉淀作用指微生物产生的某些代谢产物与重金属结合形成沉淀的过程。在厌氧条件下，硫酸盐还原菌中的脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和肠状菌属（Desulfotomaculum）可还原硫酸盐生成硫化氢，硫化氢与Hg2+形成HgS沉淀，抑制了Hg2+的活性[11]。某些微生物产生的草酸与重金属形成不溶性草酸盐沉淀。
1.2.3 胞内积累作用
胞内积累作用是指重金属被微生物吸收到细胞内而富集的过程。重金属进入细胞后，通过区域化作用分布在细胞内的不同部位，微生物可将有毒金属离子封闭或转变成为低毒的形式[12]。微生物细胞内可合成金属硫蛋白，金属硫蛋白与Hg、Zn、Cd、Cu、Ag 等重金属有强烈的亲合性，结合形成无毒或低毒络合物。如真菌木霉、小刺青霉和深黄被包霉通过区域化作用对Cd、Hg都有很强的胞内积累作用[13]。研究表明，微生物的重金属抗性与MT积累呈正相关，这使细菌质粒可能有抗重金属的基因，如丁香假单胞菌和大肠杆菌均含抗 Cu基因，芽孢杆菌和葡萄球菌含有抗Cd和抗Zn基因，产碱菌含抗Cd、抗 Ni及抗Co基因，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中含抗As和抗Sb基因。Hiroki[14]发现在重金属污染土壤中加入抗重金属产碱菌可使得土壤水悬浮液得以净化。可见，微生物生物技术在净化污染土壤环境方面具有广泛的应用前景。
2.重金属污染土壤微生物修复技术及其研究进展
微生物修复重金属污染的技术主要为原位修复和异位修复。微生物原位修复技术是指不需要将污染土壤搬离现场，直接向污染土壤投放N、P等营养物质和供氧，促进土壤中土著微物或特异功能微生物的代谢活性，降解污染物主要包括：生物通风法（bioventing）、生物强化法（enhanced-bioremediation）、土地耕作法（1and farming）和化学活性栅修复法（chemical activated bar）等几种。异位微生物修复是把污染土壤挖出，进行集中生物降解的方法。主要包括预制床法（preparedbed）、堆制法（composting biorernediation）及泥浆生物反应器法（bioslutrybioreactor）。
2.1 生物刺激技术
生物刺激即向污染的土壤中添加微生物生长所需的氮、磷等营养元素以及电子受体，刺激土著微生物的生长来增加土壤中微生物的数量和活性。关于这方面的研究国外文献已有报道。Reddy KR，Cutright T J对铬污染土壤的微生物修复进行的研究表明，限制铬污染场地修复进程的一个共同因素是污染场地通常缺乏足够的营养以供引进的外来微生物或土著微生物生长，以至这些微生物自身具备的还原Cr6+的潜力得不到充分发挥；为使其潜力得到充分发挥，需向其生活的环境中投加营养物质来刺激铬还原菌的新陈代谢和繁殖，促进铬污染土壤的修复[15]。HigginsT E将堆肥、鲜肥、牛粪、泥炭加入铬污染土壤进行原位修复，提高了修复效果[16]。
2.2 生物强化技术
生物强化技术即向重金属污染土壤中加入一种高效修复菌株或由几种菌株组成的高效微生物组群来增强土壤修复能力的技术。所加入的高效菌株可通过筛选培育或通过基因工程构建，也可以通过微生物表面展示技术表达重金属高效结合肽，从而得到高效菌株。
2.2.1 高效菌株筛选
高效菌株有2个来源：一是从重金属污染土壤中筛选；二是从其他重金属污染环境中筛选。从重金属污染土壤中筛选分离出土著微生物，将其富集培养后再投入到原污染的土壤，这是本土生物强化技术（本土生物强化技术是由日本科学家Ueno A等人于2007年首次提出的[17]）。筛选、富集的土著微生物更能适应土壤的生态条件，进而更好地发挥其修复功能。目前已从Cr（VI）、Zn、Pb污染土壤中筛选分离出菌种Pseudo-monasmesophillca和maltophiliaP，Barton等对这2种菌株去除Se、Pb毒性的可能性进行了研究，发现上述菌种均能将硒酸盐、亚硒酸盐和二价铅转化为不具毒性且结构稳定的胶态硒与胶态铅。Robinson等研究了从土壤中筛选的4种荧光假单胞菌对Cd的富集与吸收效果，发现这4种细菌对Cd的富集达到环境中的100倍以上[1]。
2.2.2 基因工程菌构建
基因工程可以打破种属的界限，把重金属抗性基因或编码重金属结合肽的基因转移到对污染土壤适应性强的微生物体内，构建高效菌株。由于大多数微生物对重金属的抗性系统主要由质粒上的基因编码，且抗性基因亦可在质粒与染色体间相互转移，许多研究工作开始采用质粒来提高细菌对重金属的累积作用，并取得了良好的应用效果[18]。
2.2.3 微生物表面展示技术
微生物表面展示技术是将编码目的肽的DN段通过基因重组的方法构建和表达在噬菌体表面、细菌表面（如外膜蛋白、菌毛及鞭毛）或酵母菌表面（如糖蛋白），从而使每个颗粒或细胞只展示一种多肽[19]。微生物表面展示技术可以把编码重金属离子高效结合肽的基因通过基因重组的方法与编码细菌表面蛋白的基因相连，重金属离子高效结合肽以融合蛋白的形式表达在细菌表面，可以明显增强微生物的重金属结合能力，这为重金属污染的防治提供了一条崭新的途径。
LamB、冰晶蛋白、凝集素、a-凝集素和葡萄球菌蛋白A都是表面蛋白，在微生物表面展示技术中用来定位、锚定外源多肽[20-21]。Sousa C等将六聚组氨酸多肽展示在E.coliLamB蛋白表面，可以吸附大量的金属离子，重组菌株对Cd2+的吸附和富集比E.coli大11倍[22]；Xu Z、Lee S Y将多聚组氨酸（162个氨基酸） 与Omp C融合，重组菌株吸附Cd的能力达32 mol/ g干菌[23]；Schembri M A等将随机肽库构建于E.coli 的表面菌毛蛋白FimH粘附素上，经数轮筛选和富集，获得对PbO2、CoO、MnO2、Cr2O3具有高亲和力的多肽[24]；KurodaK、UedM将酵母金属硫蛋白（YMT） 串联体在酵母表面展示表达后，四聚体对重金属吸附能力提高5.9倍，八聚体提高8.7倍[25]。表面展示技术用于重金属污染土壤原位修复的研究虽然取得了许多成果，但离实际应用尚有一段距离。其主要原因是用于展示金属结合肽的受体微生物种类及适应性有限，并且缺乏选择金属结合肽的有效方法[19]。
3. 结论与展望
从目前来看，微生物修复是最具发展和应用前景的生物修复技术，人们在微生物材料、降解途径以及修复技术研发等方面取得了一定的研究进展，并展示了一些成功的修复案例。但重金属污染土壤原位微生物修复技术目前还存在以下几个方面的问题：（1）修复效率低，不能修复重污染土壤。（2）加入到修复现场中的微生物会与土著菌株竞争，可能因其竞争不过土著微生物，而导致目标微生物数量减少或其代谢活性丧失。（3）重金属污染土壤原位微生物修复技术大多还处于研究阶段和田间试验与示范阶段，还存在大规模实际应用的问题。（4）微生物个体微小，难以从土壤中分离；重金属回收困难。
污染场地应用是各种生物修复技术研发的最终目的。一般说来，实验室的微生物修复研究，因修复条件较为理想化，扰因素极少，其修复可能很好。如一旦将室内的微生物修复技术放大到现场条件下，干扰因素复杂，一系列的新问题可能会出现，甚至可能会遭致完全否定等现象。因此，微生物修复技术的场地应用是一项复杂的系统工程，必须融合环境工程、水利学、环境化学及土壤学等多学科知识，创造现场的修复条件，如土地翻耕、农艺措施、添加物质、高效微生物、植物修复，季节更替等，构建出一套因地因时的污染土壤田间修复工程技术。
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合成生物技术产业的不断更新发展为人类社会所存在的一些较为难以突破的问题寻求到解决的方案，并且起到实质性的作用。合成生物技术产业简而言之就是利用合成生物技术的产业化发展，合成生物技术的发展基础就是基因、细胞这些微小单位，在此基础上进行相应的研究，主要研究方向就是生物产业的设计化、工程化，将基因与计算机编程、网络等相结合，进行各种传感性研究以及细胞编程的定向进化等，其对于社会的进一步发展有较为重要的导向作用。但其发展中的问题层出不穷，对于社会伦理、社会环境而言都是巨大的挑战。我国对于合成生物技术产业发展制定了一套合理科学的战略方针，针对其出现的问题提出了相应的政策进行限制。
1 合成生物学技术
合成生物学技术主要包括生物能源、农业及医药等方面，合成生物学技术的发展可以促进我国生产技术的快速发展。现阶段合成生物学技术在发展过程中存在很多问题，对其快速发展产生了极大的影响。目前，合成生物学技术在发展过程中产生了一套适合其发展的模式，本文主要对以下三个方面进行分析：
1.1 发展合成生物学技术发展的原因
合成生物学技术需要快速发展的原因是为了有效地满足人们的精神及物质需求，就是在社会经济快速发展的现阶段有效地增强人们的寿命及身体健康和对精神的需求有所提高；采用或者引用新技术有效的改善现阶段环境的严重污染。在这样的背景下，合成生物学技术就必须快速发展，成为我国现阶段发展的重要领域，加上人们对动植物及人类本身的研究不断深入，合成生物学技术在研究过程中也在不断提升，使其研究范围也在不断扩大。在研究过程中可以发展各种生物的作用及意义，并且可以有效地发现其生理及生长原理，使合成生物学技术在我国发展过程中发挥着至关重要的作用。
1.2 合成生物学技术产业发展战略的前提
在我国现阶段，合成生物学技术发展的主要目标就是解决其在发展过程中存在的许多问题，其中存在问题的主要原因就是因为合成生物学技术严重影响了现阶段自然进化的绝对性，对生物进化产生了人为的影响。物种出现变异或者其发展方向出现偏差的主要原因就是因为人工生物体及生物实验等的出现，合成生物学技术的出现严重地违背了生命的进化法则及生物的自然生长规律，对目前环境的自然化发展产生了严重的影响。因为人们对自然生长规律进行了过度的改造，就会严重破坏生态平衡，所以必须对自然生长规律的研究方向及研究范围设置一定的方案，并且进行一定的限制，提出适应现阶段社会发展的战略目标。
1.3 我国合成生物学技术发展战略
现阶段，合成生物学技术发展的战略目标制定的基础就是自然繁衍规律、自然生长法则及我国环境的发展详情等情况，对产生制定发展目标的主要原因就是促进该产业的快速发展，使该产业在发展过程中存在的问题得到有效的解决，并具有促进该产业快速发展的作用。我国在发展该产业的过程中应该遵循的主要原则就是尊重自然、尊重科学、尊重资源的有效利用及人类发展规律等原则，在这些原则的制约下可以制定有效的发展战略目标，可以有效地促进我国现阶段能源、农业及工业的快速发展，有效地减少环境的污染，促进合成生物学技术的快速发展。
2 生物功能元件
2.1 生物功能元件的设计、合成和功能表征
众所周知，生命的形态呈现多样性，其可以合成现有的有机化合物为新的生命系统。目前，所谓的遗传信息具有编辑性的特点，为创造新的生命系统提供可靠的保证，合成生物学的基础就是生物功能元件，是一种最小的生物元件，并且具有特定的功能，是氨基酸与核苷酸序列进行不同组合，形成一种复杂的系统。在理论上，任何有机化合物和新种的合成可以通过生物功能组件的设计和组合来实现。另外，使用新核酸及非天然氨基酸的开发，对遗传密码子表进行不断扩张，可以有效地扩大新品种的合成及化合物的使用范围。伴随着现阶段DNA合成技术的商业化及不断发展，基因原件的保真性及质量的不断提高，同时其成本也在不断降低，为合成大量的基因原件提供便利，而且通过使用高通量筛选技术可以有效地加强人员对基因原件的选择。
2.2 生物功能元件的标准化
目前，伴随着合成生物学的快速发展，人们需要对生物学的功能原件进行规划。1996年，Rebatchouk等通过克隆的方式有效地建立了基因元件库，但是当时这项工程并没有引起行业人员的注意。2003年，Kight在麻省理工学院提出了“生物砖”概念。现阶段，许多科研院也在开始使用规范的基因元件库进行生物系统和生物装置的监理。所谓的生物砖就是对生物功能组件的标准化进行不断尝试，简单而言就是单个的积木通过不同的方式进行排列组合，可以组成许多不同结构的形态，通常情况下，生物砖的基础元件主要包括调节序和编码序列，如核糖体结合位点、终止子及启动子。2003年，通过麻省理工学院建立了标准生物元件库，现阶段应该收集了3400多件基因元件有效的应用与组装生物系统和生物装置。这些标准化元件一般都来自于每年参加国际遗传工程机器设计竞赛、科学家个人和学术研究机构等团队。每个单独的元件都有自己的编码，其中还有建造者、使用者、序列及功能等资料，这些资料都是公开的，可以免费使用。
2.3 生物功能元件的组装
合成生物学技术的主要特点就是对基础元件进行重新的排列组合，得到不同的系统及相关的装置，但是因为人们发展研究的限制及生命系统的复杂性，合成生物学技术不能像建筑工程及其他学科的项目一样，对具有特定功能的元件进行排列组合，就可以得到应有的效果及功能，同时需要对各个元件、装置及设备之间进行不断优化及调试；同时最为主要的影响因素还有底盘、装置及元件，而在这个过程中，使用系统生物学分析方法和高通量的测试方法对其进行优化和试配。通过使用计算机辅助动态仿真技术，对构建的模型进行不断的预测，并对其进行优化，这样可以有效地降低模型的测试工作量，有效地加快模型的构建进度，对构建模型的过程中所产生的数据进行重新组合、预测其功能，可以有效地构建出接近自然生物系统的模型，最终得到最佳的施工方案。
3 DNA合成与组装技术
3.1 DNA合成
DNA化学合成的主要成分就是基因合成和寡核苷酸合成。寡核苷酸合成通常情况下是使用固相亚磷酸胺三酯法，原料为核苷酸单体，经过脱保护、偶联、封闭与氧化四个循环反应的过程进而得到的。这种方法通过一定的优化措施，以1/200的错误率最多可以有效地合成200～300nt的寡核苷酸序列。在20世纪90年代初期，促使实现寡核苷酸的高通量合成的主要因素就是芯片技术。但是因为“边缘效应”及“脱嘌呤”现象的出现，对合成序列的正确性产生了一定的影响。由于CustomArray开发的通过半导体电化学酸合成与Agilent开发的通过喷墨打印技术的芯片合成后，有效地改善了出错率，与柱式的合成相当。但是这种方式的单次合成数量是柱式合成数量的100～10000倍，所以可以有效地降低DNA的合成成本。
3.2 不同尺度的DNA组装方法
为了对合成基因序列的可靠性进行控制，通常情况下DNA的合成长度不能超过5kb，而更大尺度的DNA分子可以通过最新的DNA组装方法实现。除了传统的克隆分类的方法，现阶段已经出现了体外DNA组装、聚合、连接或同源重组原理等多种体内的新方法。这些方法被大量使用，促使DNA组装不管是效率还是尺度都得到了快速的
发展。
2008年，Venter研究组有效地完成了580kb生殖道支原体的人工建立，并在2010年实现了人造生命的重头合成方式，有效地促进了现阶段合成生物学的快速发展。在这一发展过程中，除了依靠低成本及高通量的基因合成方法外，主要使用酵母体内拼接及Gibson组装的方法进行开发，通过这种方法，有效地实现多个片段的一次性无痕拼接，其现阶段组装尺度最大为580kb。
综上所述，现阶段，合成生物学技术出现及快速发展与人类认知及自然科学方法息息相关。自然科学方法主要是从细胞、个体、分子到群体等多个方面指导人们对自然的认识，有效地揭示规律、生命及机制，随着人们对自然认知的不断深入，人类的认知不能满足自然的传统描述，所以合成生物学就会逐渐出现。同时，合成生物学是工程实践的前提，是理解和分析自然生命系统的关键，对生物系统、装置的特征进行分析，从而出现简单的生物装置及元件的设计、组成标准化的规律及原则，然后指导人工生命生命系统的设计和施工。另外，属性合成生物学的设计和建设的“自下而上”的正向工程理念和“标准化”“复杂的系统脱钩”和“抽象”的理念，这与传统的生命科学研究存在一定的差异，而且合成生物学家的指导，导致设计和建造的城市标志性建筑的路标。同时组件、系统和寿命设计与施工可以系统地深入和了解生命的本质规律，从而可以有效地指导应用性及工程化的设计及建造，这是合成生物学的一个重要理论。
参考文献
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中图分类号：X793 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）04（a）-0000-00
随着国民经济的不断发展，各行业工业废水的排放量也在逐渐增加。其中，造纸工业排放的废水对水环境造成了严重的污染。统计数据显示，我国10000多家的大中小型造纸企业，每年就会排出40多亿t的污水，占到了全国废水排放总量的十分之一[1]。2010年，造纸废水CODCr排放95.2万t约占轻工行业CODCr排放总量47%[2]，对生态环境造成难以想象的破坏后果。对此，对新型的有效治理造纸废水污染的方法以及途径进行探索和研究，是非常具有研究意义和现实意义的。
1 造纸废水的来源和特点
其生产的各个环节都会产生废水，但主要来自于中段水、纸机白水以及蒸煮液[3]。提取黑液后浆料在洗涤、筛选、漂白的过程中排出来的废水，就是中段水，这种废水成分复杂，且富含对环境危害较大的有机氯化物。纸机白水中主要有细小纤维、填料和胶料（松香等）。酸法制浆的红液或碱法制浆的黑液叫蒸煮液，在整个造纸工业污染中占90%。碱法制浆是我国造纸业普遍采用的，其主要成分是纤维素、木质素、半纤维素、单糖、有机酸和碳水化合物的降解产物等。
2.造纸废水生物处理技术
化学方法、物理方法、生物法、物化方法等，是目前国内外造纸污水处理的主要方法。近几年，得到人们重视的膜分离、超临界分离、磁分离、超声波分离等物化处理法因比较昂贵，处理效率不高，应用比较有限。而操作方便、运行费用相对较低、没有二次污染等优点的生物处理法，则越来越受重视。
2.1好氧处理技术
指借助于好氧或兼性厌氧微生物在有溶解氧的情况下来分解、吸收有机物，使之被氧化成简单的无机物，污水得到净化。当前，活性污泥法和生物膜法等好氧生物法是国内外用来处理造纸废水的方法。
处理效果较好且成本低的活性污泥法既能去除部分色度，还能分解大量有机物质，易于管理是我国最常用的好氧处理方法。崔延瑞等[4]采用序批式活性污泥法处理碱法草浆造纸废水，COD的去除率高达80%。张述林[5]等采用混凝与低氧―好氧两段活性污泥法来处理某造纸厂COD为6230mg/L的综合废水，可达93.8%的COD去除率。
生物膜法是指微生物附着在介质表面上形成生物膜，且在不断繁殖生长的同时，还能对污水中的有机污染物进行降解吸收，将其转化为稳定的无机物和原生质，从而达到净化污水的作用。此方法剩余污泥量少且不会产生污泥膨胀，占地少，运行管理方便。Chandler等[6]通过塑料填料，利用两级生物膜反应器中试处理造纸厂废水。结果显示，水力有3h的停留时间，可减少93%的BOD5，出水BOD5达到7.83mg/L的平均浓度。张苗等[7]采用混凝沉淀协同好氧生物膜技术深度处理造纸废水，结果显示，效果最为显著的就是以FeCl3为混凝剂的协同好氧生物膜技术，最高可达69.30%的色度去除率，比单独的混凝沉淀高了3.72 %的去除率。
2.2厌氧处理技术
在专性与兼性厌氧菌的条件下，通过发酵和分解对有机物进行降解的处理技术称为厌氧处理技术。与好氧处理技术相比，其污泥产量小、节省动力能耗、对营养物质需求不高，且能更好地降解某些难降解有机物。殷承启等[8]采用上流式厌氧污泥床（ UASB）处理二次纤维造纸废水。UASB 稳定运行时对COD的去除率可达90%以上，总硬度在50%以上以及硫酸根离子80% 以上。刘峰等[9]研究了预酸析―多孔高分子载体固定化微生物厌氧流化床（AFB）处理碱法草浆黑液的效能，结果证明，AFB对黑液进行直接处理时，发挥了其活性生物量浓度大、传质能力强的特点，可有效地去除COD，色度亦有所下降。采用酸析预处理利用AFB的厌氧消化功能，可去除黑液中大部分难生化降解的高分子物质。
2.3 厌氧-好氧处理技术
造纸废水因难降解有机物成分多、污染物浓度高、废水流量和负荷波动大、有较差的可生化性能等，用好氧处理效果不好且能耗大。因此，利用厌氧-好氧组合处理工艺进行处理。首先，能使厌氧处理技术的优势充分发挥，水解、酸化废水中生化性很差的高分子物质，成为易于进行好氧处理的较小分子或分子结构。同时，也可对回流到厌氧池的好氧阶段污泥进行较为彻底的厌氧消化，减少整个系统的污泥排放。该工艺结合了厌氧与好氧处理技术的优点，具有占地面积少、处理效果好、能耗低、节省药剂以及运转、管理方便等优点。
丁志芬[10]对某造纸厂应用厌氧-好氧组合技术处理废水的情况进行了介绍，且和好氧工艺作了比较。结果证明，厌氧-氧工艺运行电费可降低50%，且运行稳定，其COD有机物85%都转化为甲烷气体了，剩余污泥量也减少了60%以上。李巡案等[11]分析了万隆造纸厂废水处理工程改建为厌氧-好氧工艺以及实行清洁生产后，污染物质排放总量明显减少，水质可达到GB18918- 2002一级A标准，与原有的好氧生物处理工艺相比可节省动力约55%。
3 生物处理造纸废水技术的研究进展
3.1 应用白腐真菌对造纸废水进行降解
造纸工业排放黑液COD和色度形成主要是因为木质素，其异质多晶三维多聚体结构是由甲氧基取代的对-羟基肉桂酸聚合而成，分子间的醚键、C-C键很稳定，是当前公认的微生物难降解芳香化合物之一[12]。目前，国内大部分工厂处理造纸废水采用传统生物法应用的微生物主要以细菌为主，并不能有效去除造纸废水中的木素衍生物以及漂白过程中产生的氯酚类物质，这便成为造纸废水达标排放的主要障碍。
白腐真菌是目前所发现的对木质素及其衍生物降解最有效的微生物。多数白腐真菌属于担子菌纲，少数为子囊菌纲。其中，黄饱原毛平革菌（Phanerochaete Chrysosporium）是已被广泛研究的典型白腐真菌。
3.1.1 白腐真菌的降解机制及优势
白腐菌降解木质素通常分两步进行[13]：第一，菌体利用菌丝吸附木质素；第二，白腐菌分泌出的酶催化氧化木质素等污染物，主要分为细胞内和细胞外两过程，整个降解系统在主要营养物质（ 碳、氮、硫） 限制条件下才得以启动形成[14～16]。锰过氧化物酶（ Mnp）、漆酶（La）、木质素过氧化物酶（ Lip） 均合成于细胞内，通过分泌到细胞外对污染物进行降解。前两者均须以H2O2为底物，漆酶以氧气作电子受体催化形成醌及自由基。故降解污染物时，白腐菌需借助H2O2激活，由酶触发启动自由基链反应，产生具有超常的氧化能力的细胞外?OH，对芳香化合物有很好的降解作用。
故白腐菌在降解污染物上所有具有的优点是其他生物系统尤其是细菌没有的[14]：（1）特定污染物不需要预条件化：处理系统以细菌为主的，诱导合成所需的降解酶须预先置于一定有效浓度的污染物。白腐真菌降解酶的诱导与降解底物的有无多少无关。（2）动力学优势：细菌对化学物的降解多为酶促转化，遵循米氏动力学。初始氧化反应的酶经白腐真菌催化启动对底物没有真正意义上的Km值，对氧化产物的形成有利。（3）产生氧化能力极强的?OH （4）有毒污染物不必进入细胞内代谢而在其细胞外即可有效降解。可忍受高浓度有毒污染物的同时，避免有毒污染物对细胞的毒害。（5）非专一性降解的特性：能降解大量结构不同的化学物质。（6）对营养物的要求低。
3.1.2 白腐菌在造纸废水中的应用
从上述可知白腐真菌在治理造纸废水方面有极大的研究价值。吴涓等[17]比较了几株白腐真菌在造纸黑液废水中的挂膜生长状况及其对黑液废水的处理效果。黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22菌都可以在较强碱性的废水中生长挂膜，且对木质素有显著的降解作用，有很强的适应废水的能力。李雪芝等[18]用8株不同的白腐菌对造纸废水进行处理，选出的白腐菌L02处理效果是最好的。该菌株可直接应用于造纸废水的处理，大幅度降低废水CODCr含量（降低84%以上）、废水的色度（降低93%以上）以及废水的pH值。路忻[19]采用序列间歇式活性污泥法（SBR）法利用白腐菌共代谢理论分析及处理试验研究含木质素的造纸废水。结果表明，相同进水COD浓度和水力停留时间，与单纯好氧生物处理相比，共代谢作用下好氧处理的COD去除率要高得多，有约30%的提高率。
3.2 生物酶技术
白腐菌降解木质素，是通过其分泌的酶的作用来实现。相较于锰过氧化物酶、木质素过氧化酶，在白腐菌木质素降解酶系统中，漆酶的实际应用价值更大一些。首先，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶产生的条件是限碳和氮的。而漆酶可在碳和/或氮存在条件下由菌体分泌[20]。其次，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶只在系统存在H2O2时，才可降解有机污染物，这在现实情况下很难实现的。最后，重要的还在于漆酶具有780 mV氧化还原电位，在不存在H2O2和其它次级代谢产物时，有机污染物的氧化也能够被催化。所以，在环境保护和生物技术方面，漆酶的应用潜力是非常巨大的。
据林鹿等人[21]研究通过漆酶进行去除桉木硫酸盐浆CEH漂白废水时发现，它可以把废水中有毒物质去除掉40%以上。造纸废液中有机氯化物用漆酶处理，具有高效能的催化作用，反应条件温和，对反应设备和反应条件要求也不高。谢益民等[22]采用杂色云芝发酵产生的漆酶液深度处理造纸厂二沉池出水，结果表明，经催化氧化作用，漆酶及其介体体系可氧化聚合废水中的大部分残余木素。在最佳实验处理条件下，木素、CODCr和色度的去除率分别达到82. 0%、76. 9% 和84. 9%。同时，纸浆生物漂白上的研究热点也包括漆酶。通过酶法漂白纸浆，脱氯效果更好[23]，相对于传统的氯气漂白法所产生的有毒的氯酚类化合物而言，其避免了对环境的污染。
3.3 生物固定化技术
微生物固定化技术是通过化学或物理的方法，把游离酶或细胞限定在一定的空间区域内，使其能反复利用且保持活性，利于除去高浓度有机物或某些难降解物质。Messner等[24]利用生物滴滤器原理而开发的MYCOPOR反应器，在多孔的载体填料上把白腐菌固定好，废水由从顶部到载体的这个过程就能够得到净化了。处理6～12h，87%、80%和40%的色度、AOX和COD可去除。李朝霞等[25]采用一种新型海藻酸钠/壳聚糖/活性炭生物微胶囊固定化白腐菌和悬浮态白腐菌，在不同接种量下降解造纸废水。结果显示，白腐菌在不同的两种状态下均能对造纸废水进行降解，不过在代谢稳定性和降解木质素能力等方面，固定化白腐菌比悬浮态白腐菌明显要强。刘帅等[26] 用固定漆酶和游离漆酶对造纸废水进行深度处理。通过对废水处理的效果对比，固定漆酶的优点在于达到最佳效果的反应时间短， 酶的稳定性高， 温度耐受性强，pH适应性显著增强。
4 结语
作为一种处理难、成分复杂的工业废水，通过传统的处理技术造纸废水已很难满足如今的排放要求。因此，要实现极大减少造纸废水的排放或者实现零排放，需大力发展微生物处理技术。使微生物与处理技术相结合，为造纸业的绿色发展铺平道路。
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篇9
据国家相关部门统计，我国城市生活污水的排放量在逐年增加，但处理能力却十分有限，大部分生活污水未经任何处理直接排入自然水体，对环境造成严重的危害。同时，由于淡水资源的缺乏，人们越来越关注生活污水回用技术的发展，在节约用水的同时积极使用生活污水作为第二水资源。因此，加强生活污水处理技术的研究具有重要的意义。
我国生活污水属于点污染源, 是人们日常生活中产生的污染, 主要来自家庭, 商业,学校旅游服务业及其他城市功用设施, 包括厕所冲洗水, 厨房洗涤水, 洗衣机排水, 沐浴排水及其它排水等。
一、生活污水的危害性
生活污水排入水体或渗入地下水将造成污染, 微生物在分解有机物时消耗水中的氧, 当溶解氧低于3~4mg/L, 就会影响鱼类的生活。当溶解氧耗尽后, 在厌氧状态下,厌氧菌分解有机物产生硫化氢, 使水体黑臭, 鱼虾绝迹。据世界卫生组织报告, 全世界80%的疾病与水有关系, 世界上每天大约有2.5 万人因水污染引起的疾病死亡; 生活污水中的氮, 磷营养物质排放到水体中, 特别是湖泊, 水库, 将引起水体富营养化, 使水体在一定时间处于严重的缺氧状态, 使鱼类大量死亡。
二、城镇生活污水处理技术研究
1、膜- 生物反应器处理生活污水
鉴于膜分离技术在污水处理中通过固液分离机制去除污染物和细菌方法有独到的优势，人们对膜分离技术应用于给水和污水处理方面进行了多途径的开发和应用。膜分离技术（如微滤、超滤）在城市生活污水处理应用方面也有了较大进展，已经部分商业化用作回用水。
膜生物反应器技术, 是将膜分离技术与废水生物处理技术组合而成的新系MBR(Membrance Biological Reactor) , 该系统以膜分离技术替代传统二级生物处理工艺中的二沉池, 具有工艺流程简单, 占地少, 管理方便, 处理效率高, 出水率可直接回用等特点。工艺流程如图2:其中, 生物处理单元为接触氧化工艺。试验装置为折流式水槽, 有效体积27L, 内装弹性立体填料, 主要性能: 丝条与中心绳材质均为聚酰胺材料; 单元直径为173mm; 耐热温膜分离单元为超滤膜分离工艺, 试验采用外压式中空纤维组件,膜材料为PS, 膜面积为1.1m2; 膜切割分子量30000; 工作压力为0~0.294Mpa 。生物接触氧化是处理生活污水的有效工艺, 可较好地对水中的非溶解性的物质进行分离, 确保处理后的生活污水能够达到中水回用标准, 系统运行稳定, 排泥很少。另外, 考虑到膜- 生物反应器的生物特性, 可以采用无泡供氧[8]的新工艺以达到更好的去污和经济效果, 同时在生物处理池中也可以同时加入铁盐, 混凝除磷效果也很理想。
图1 膜- 生物反应器处理生活污水工艺流程图
2、活性泥技术
简单来说活性泥技术就是利用活性污泥去除水中的有机物。首先是回流的活性污泥和污水同时进入曝气池，并将空气打入曝气池，使污水和活性污泥充分混合，曝气池中微生物吸附、混合液进入二次沉淀池进行分离操作。最后就可以向外排放净化后的水，分离出一部分活性污泥通过回流系统，回流至曝气池，另一部分将从系统出中排出。活性泥技术的主要设备为曝气池和二次沉淀池。由活性泥技术，还衍生出了很多更先进的方法，例如AB 法和SBR 法。在SBR 法的基础上，又发展出了CAST 法，即循环式活性污泥技术。作为目前比较先进的污水处理技术，CAST 法具有以下几点优势：1）生物选择区的设置有助于抑制污泥膨胀。2）高效的同步硝化与反硝化。3）健全完善的生物除磷系统。4）抗冲击负荷功效显著。但是由于这种技术正处于起步阶段，各方面的性能于功效还不够完善，以此对其进行更为深入的分析研究使其在原理、操作等各方面得到不断的发展与完善，是目前亟待解决的问题。但作为新兴技术的代表，CAST 法无疑还是有很好的发展前景的，而作为其根源的活性泥法，无论从实用性还是发展潜力来说，都是目前的佼佼者。
3、生物接触氧化法
生物接触氧化法就是在生物接触氧化池内安装一定数量的填料，为了使污水达到净化的目的，通过填料上的生物膜和供应的氧气发生生物氧化作用，以此来将氧化分解废水中的有机物。生物接触氧化法是生物法处理废水中的一种重要方法。生物接触氧化法是一种高效净化有机废水的处理工艺。其不但具有生物膜法的特点，还具有活性泥法的优点。该方法不但适用于处理生活污水，还适用于工业污水和养殖污水等，并且已经取得了较好的处理效果和经济效益。生物接触氧化法具有高效节能、耐冲击负荷等优点，并且被广泛应用于污水处理系统中。
生物接触氧化法是生活废水经过物理处理后的重要环节，也是整个处理工艺中的重要环节，经过生物接触氧化法的处理，亚硝酸和硫化氰等有害物质都可以被有效的除去，对后续的处理工艺起到重要的关键作用。
同一般的生物膜相比，生物接触氧化法是以生物膜吸附废水中的有机物，通过微生物和供应的氧气发生生物氧化作用，净化废水。一般来说，在氧化池内的生物膜主要是由菌胶团、丝状菌和真菌等微生物组成。生物接触氧化法同和普通生物膜法相比，区别在于填料的应用，也就是微生物在氧化池内的状态不同。例如：对于活性污泥法中的丝状菌，是会影响生物净化作用的因素。但是在生物接触氧化池内，由于填料的存在，使丝状菌呈立体结构，增加了与废水接触的表面面积，而且丝状菌对有机物，具有氧化能力，并且适应负荷变化较大的水质，可以极大地提高净化的能力。
生物接触氧化法具有以下几个特点：1）容积负荷高，耐冲击负荷能力强；2）具有膜法的优点，剩余污泥量少；3）具有活性污泥法的优点，辅以机械设备供氧，生物活性高，泥龄短；4）能分解其它生物处理难以处理分解的物质；5）容易管理，消除污泥上浮和膨胀等弊端。生物接触氧化法优点众多，但也有几处弊端，首先是滤料间水流缓慢，水力冲击力小。并且生物膜只能自行脱落，剩余污泥不易排走，滞留在滤料之间容易引起水质的恶化，影响处理效果。同时，滤料的更换和建筑物的维修比较困难。但是，随着未来技术水平的不断研究与发展，以上几个问题必将得到很好的解决。
总之，这些方法由于各自具有不同的优点和缺点, 通过科学设计、优化组合，可望在实际应用中获得技术与功能上一定程度的互补, 有效降低城镇生活污水的处理与运转费用, 从而推进城镇生活污水处理的技术革命。
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篇10
1.1膜分离技术的简介
膜分离技术是指借助膜的选择渗透作用，在外界能量或化学位差的推动作用下对混合物中溶质和溶剂进行分离，分级， 提纯和富集。根据膜材质和孔径大小的不同，我们可以将膜分离技术分为一般微滤（MF），超滤（UF），反渗透（RO），纳滤（NF）等等。
膜分离技术自从20 世纪60年代被用于工业生产以来，经历了膜材质从大孔径到小孔径，推动力从重力场到多种电化学作用共同作用的发展模式。自从上世纪90年到之后TFC膜（低压聚酰胺复合膜）的成功研制之后，膜分离技术在现代化工和生物工程的各个方面都得到了广泛的应用。
1.2膜分离技术的独特优势
而在这些现代分离技术中，膜分离技术的基本原理是利用高分子薄膜的选择透过性为分离的基本原理，以压力差，电势差，电渗差等为动力，以达到物质在薄膜间的传质而达到分离的目的。因此在经历了：微孔过滤，渗析，电渗析，反渗透，超滤，气体分离，渗透气化等发展过程后[1]，现代膜分离技术具有反应条件要求低（常温下即可发生）；是一个物理过程，不发生化学变化所以损耗较小；膜分离过程中多以压力差为动力（渗透压也包括在内）；膜的性质稳定的情况下膜分离系统可以有极大的分离范围；膜分离过程的研究比较透彻，分离的流程控制比较容易控制从而得到更高纯度的分离产物[2]。这些优点都使得它在实际运用中都具有很高的价值，而被广泛使用在工业和科研中。
1.3膜分离技术与生命科学的结合
近些年来生物领域飞速发展，一系列系统理论的建立使得生物科学向更精细更严谨的方向发展，人们对于生物制品需求扩大的同时对其的安全性可靠性的要求也越来越高。尤其是分子生物学的建立使得生命科学的范畴更加靠近生命的本质。而随着分子生物学的发展，它对与物质的分离与鉴定的要求也越来越高，传统的分离手段已经无法满足，但膜分离技术等为代表的现代分离技术（其特点前文已述）却很好的迎合了他的需求，因此被广泛的运用于科研与实际生产过程中。
2现代膜分离技术的基本过程与原理详细
2.1膜分离技术的基本原理以及其分类
以压力差为推动力的液体膜分离过程通常可根据分离对象的大小和膜的不同分为微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）。根据待分离样品的性质以及分离所选用薄膜的性质尤其是薄膜的孔径的大小还有分离纯度，分离时间，分离速率等方面的要求可以有针对性的选取合适的分离方法，以达到分离预期结果[3]。
2.2膜分离技术的不同操作模式
膜分离技术原理简单，因此它的工艺流程也便于标准化。由于待分离物质中我们想要的目的产物的分子量各有不同，我们的目标产物最终出现的位置也不同：小分子物质一般会通过薄膜最终在滤过液中富集。而大分子物质会在膜的另一侧由于无法滤过被截留在浓缩液中。为了使膜分离过程中的损耗尽可能的小，时间尽可能的短，我们会在料液中添加渗滤溶剂，它可以和小分子组分互相作用和小分子物质一同穿过薄膜从而加速小分子物质过膜速率，使大分子与小分子物质的分离加速，从而解决了高浓度的溶液过膜速率过慢的问题。收集浓缩液得到其中被截留的大分子称为浓缩。与此不同，利用渗滤溶剂进行的膜分离过程称为渗滤。
在实际工作中二者往往搭配使用，操作过程由预浓缩、恒容渗滤和后浓缩三个阶段组成：利用浓缩模式使料液的浓度上升，在过膜速率出现了明显下降的时候转化为渗滤模式，从而达到克服高浓度料液透过速率低，减少浓差极化与膜污染的目的，加快分离速率以免影响物质活性的目的。有时为使纯度达到要求还可以采用多级分离的方法从而使物质分离的更加彻底。
在选择具体的膜分离方式时，我们要考虑的因素有：与上下操作间的衔接，对于膜使用寿命的影响，分离效果的好坏等等。
2.3膜分离的计算模型以及效果衡量
膜分离的传质原理有两个主流理论：双模理论和溶质穿透理论。
双模理论认为，气液界面间存在的气膜和液膜集中了主要的传质阻力，溶质分子在这两个膜层内梯度扩散，按照Fick第一定律进行计算。
其中，J为扩散速率，D为扩散系数，dC/dX为浓度梯度。
溶质穿透理论认为，气液两相在接触前都是均一的，接触后开始互相扩散。靠近界面处溶质浓度大。在一定时间后，液体达到均一饱和状态，此时两相处于动态平衡状态。可以按照Fick第二定率计算。
其中C为浓度，t为时间，D为传质系数，x为离界面的间距。其中D与浓度无关，否则要修正为：
衡量膜的好坏时主要看膜的分离性能与透过性能，主要是指截留率，分离系数，浓差极化，压密，膜污染速率等系数。但是在工艺上来说膜分离效果的衡量主要包括两个主要参数：分离时间与分离效果（主要用小分子去除效果来衡量）。
2.3.1分离效果，以小分子去除效果为例：
公式右端是大分子物质浓度除以小分子物质浓度，可以用来表示小分子物质的去除效果。
公式左端表示的过程是料液稀释后，再浓缩至原体积，重复n次。S1与S2分别表示经过膜前后溶液中小分子物质的浓度。
3膜分离技术在生物科技领域使用的具体实例
3.1膜分离技术在小分子有机物分离过程中的应用
常常使用膜分离技术进行分离的小分子物质包括：多肽，氨基酸，抗生素，乳酸，低聚糖等。此处以氨基酸为例进行分析。
氨基酸的膜分离：由于氨基酸本身是两性物质，有自己的等电点，因此我们在分离氨基酸时往往还会调节料液的PH值，而且大多采用纳滤膜以利用纳滤膜的带电性质以达到最大分离截留效果[4]。对氨基酸分离用纳滤膜分为高分子复合膜和无机陶瓷膜，其分离性能与氨基酸混合体系和操作条件有。关有人用ZrO2膜表面接枝交联PEI的有机-无机复合纳滤膜（膜的等电点为1018），进行了9种氨基酸（其中酸性2种，碱性3种，中性4种）混合物的膜分离实验。在pH=2时，带正电的碱性氨基酸被膜截留（透过率小于25%），而中性和酸性氨基酸的膜透过率大于85%；在pH=12时，带负电的酸性氨基酸被膜截留（透过率小于30%），而中性和碱性氨基酸的膜透过率大于80%，由此可以看出通过改变膜电性与料液的PH值可以分离大多数的氨基酸[5]。
3. 2膜分离技术在蛋白质分离中的应用
蛋白质是一类以复杂的混合物形式存在的生物大分子，传统的蛋白质分离方法主要有萃取法、沉淀法等，这些工艺往往操作繁杂、耗时长、蛋白质易变质，且产品的回收率低、二次污染严重。膜分离技术则可以很好地克服传统蛋白质分离技术的缺点，有效改善产品质量，还可以大大提高蛋白质的回收率，实现蛋白质的分离和纯化。一般蛋白质的膜分离会用两张膜：一个膜孔较小，能使需要的蛋白质全部截住，而让小的蛋白质透出，然后再将截留在第一张膜内的蛋白质转移到孔径较大的膜内，截住较大的蛋白质使所需的蛋白质流过微孔透出，这样使蛋白质得到了提纯，如果还有杂蛋白还可以再接着进行类似流程。比如说美国农业部利用膜技术分离精制了霍霍巴榨油后残渣中的蛋白质、纤维素等成分，分离后各组分分别作为动物饲料及调节剂；还有Muller等采用 ZrO2/Al2O3无机超滤膜从酸性酪蛋白乳清中分离α-乳清蛋白，显著提高了α-乳清蛋白的纯度和产量[6]。
3. 3膜分离技术与膜生物反应器
膜生物反应器是一种近些年来膜技术与生物技术结合研究应用于生产的热门方向，主要是将微生物与膜结合控制料液在膜中的流动利用微生物的各类生化作用来起到去除料液中某些杂质而且可以得到并分离产物的目的。现阶段主要运用于污水高效处理，已经有部分进入工厂使用。这里选择性介绍无泡曝气膜生物反应器与萃取膜生物反应器[7]。
3.3.1无泡曝气膜生物反应器。
生物反应器在作用中由于大量污泥（就是大量具有强分解作用的微生物的载体）的存在其过大的需氧量一直是限制其应用的主要原因。而无泡膜生物反应器能很好地解决这一问题。它一般采用的是中空纤维膜，膜的一端封住，空气或O2在膜的内腔里流动，在浓差作用下向膜外侧的活性污泥传递。气体进入污水中不产生气泡，而且氧的传递效率高达100%，可以满足各种微生物生化反应的需氧要求。
3.3.2萃取膜生物反应器。
当废水中含有对微生物有毒害作用的成分（很高浓度的盐、很大的酸碱度或者是生物难降解的有毒有机物等）时，直接用生化法是不适宜的。
而萃取膜生物反应器能很好处理这些废水。萃取膜生物反应器中，污泥与废水并不直接接触，废水在膜腔内流动，而活性污泥则在膜外流动。活性污泥中的微生物一般是针对废水培养出来的专性细菌。采用的膜一般是疏水性的硅橡胶膜，且有选择透过性，能允许挥发性有机物透过而水及无机成分则无法透过。首先污染物在膜中溶解扩散，再以气态形式离开膜进入膜另侧的混合液中，在混合液中由专性菌分解成CO2、H2O等无机小分子[8]。
3.4膜分离技术在医药有效成分提取中的应用
3.5膜分离技术在酿酒中的应用
白酒酿造过程中，如果使用传统固态发酵方法，不可避免的会产生甲醇，油性脂肪酸，醇油等杂质，它们会影响产品口感，外观，其中甲醇对人体有极大危害。因此这些物质的分离会对白酒品质产生极大影响。
有人研究发现，超滤和微滤是有效的分离此类杂质的手段。在低酒精度下进行膜分离，可以有效的延长产品的保质期，改善口感，却对其其他理化指标并不产生太大的不良影响（总酸总酯会有所下降）。对于清香型白酒，一般稀释到28到30度之间过非对称的活性炭吸附膜，之后再于低温下保存（18摄氏度），可以有效避免失光，浑浊等现象，同时降低苦味辛辣味，和蒸馏产生的蒸煮味。
除此之外，在啤酒的发酵过程中由于采用了代谢控制发酵的方法，往往会有较高的残糖，而使用反渗透过滤之后，也将将有效降低残糖，达到改良口感的效果。
3.6其他
膜分离技术还广泛的运用于其他产业：高品质饮用水的过滤，发酵废液的再利用。
4总结
膜分离技术从产生到现在已获得巨大的成功，但仍属于一门发展中的年轻综合性学科。理论和应用上都有大量的问题有待解决。比如说：膜寿命过短，易污染；料液粘度大，往往流动性较差；料液固体含量高，膜通量衰减快；膜类型不足，工艺经验不足等等 [3]。
总的来说膜分离技术与生物技术的结合无疑是成功的而且还是潜力巨大的，可以想象在解决了这些问题后这项技术的前景将会多么诱人。
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篇11
1 微生物发酵概述
生物发酵工程的概念较多，现代意义上关于生物发酵工程的理解为：在合适的pH酸碱度值、阳光照射度、培养基等条件上，利用微生物的一些特点，并借助一些现代工程技术对微生物进行生产，从而培育出一些能够满足人类进行生产活动的物质，或是将微生物用于现代工业生产的一种技术体系。
微生物发酵过程的优化控制可以分为过程模型和控制策略。发酵过程建模如机理分析建模、黑箱建模和混合建模近年来都得到了快速的发展，而优化控制策略方面的研究内容与成果有：基于线性化近似的经典优化控制、基于非线性系统理论的优化控制以及基于人工智能技术的优化控制等。微生物发酵过程控制技术的优化决定着发酵工程的质量与效益。传统的发酵工程过程为了快速提高发酵生产率与发酵水平，发酵过程更侧重于菌种的筛选和改造上。随着生物科学技术的发展，基因工程与代谢工程研究领域都出现了长足的进步与发展，利用基因重组与诱发等技术可以实现高产菌株普遍生产。但只有通过发酵过程的优化控制，才能实现产品质量最高、生产力最大、成本消耗最低的生产过程，因此对微生物发酵过程的优化控制成为发酵工程中研究人员日益关注的焦点。
2 存在的现状
现阶段，微生物发酵工程面临的一大问题是自动化控制问题。为了顺利解决该难题，首先应对微生物的不同特点有充足的了解。在科学技术快速发展的背景下，人们了解微生物的方式已经发生了改变，已经由原来的借助微生物形态进行表面认识，转变为对复杂生物学与细胞调节等方面。然而，微生物细胞较复杂，这使得生物发酵工程也变成了一类重复性差、高度非线性、慢性变、复杂的生化过程。因此，在研究过程中，不可仅从表面对生物发酵过程进行分析，而根据检测得到的过程参数对生化发酵过程进行详细分析。一般来说，检测的过程参数主要包括物理参数、生物参数与化学参数这几类。
3 生物发酵过程的在线检测与控制技术进展分析
微生物发酵过程属于一种生化反应过程，主要是为了促进最终产物利用率的提升，确保微生物生长环境的舒适度。在舒适、适宜的环境中，有利于微生物进行有效的生长代谢，并能实现对微生物发酵过程的在线检测与控制，从而提升微生物发酵产品的利用率，发挥其最大作用。具体来说，主要包括以下几个方面。
（1）电机搅拌热、冷却水温度、微生物发酵热等因素，均可能影响发酵的温度。此外，发酵罐体积大小，也会在一定程度上影响发酵温度的控制。如果发酵罐的体积较大，往往会采用冷却水或发酵温度为主回路的串级控制方式；如果是体积较小的发酵罐，多采用冷却水流量、发酵温度为主的简单回路控制方式。
（2）在微生物发酵过程中，生物发酵也会受溶解氧浓度的控制情况影响。然而，现阶段国内对该方面的研究较少，仅限于了解到哪些因素会对溶解氧浓度产生影响。目前，影响溶解氧浓度的因素主要有：供给的空气量、发酵罐本身的压力、搅拌桨的转速及形状。
（3）在微生物发酵过程，pH酸碱度值也是影响在线检测与控制的一个重要因素[4]。若pH酸碱度值过高或过低，微生物的生成及代谢过程都会发生变化，故必须保证酸碱度值得合适。若发酵液的酸碱度为强酸性，可通过加氧水的方法弱化其酸性；若发酵液浓度为强碱性，可通过加糖的方式弱化其碱性，调节发酵液的酸碱度，直至合适。
（4）消泡控制也是影响生物发酵工程的一个重要因素。发酵前，微生物的生长往往较旺盛，而此时若加满液料，并将搅拌桨马达最大速度启动，空气通入量也加到最大，很容易导致发酵液上浮的现象，最终发生逃液现象。若发生该类情况，一般会采用双位式控制方法进行处理，可取得较好的效果。
（5）在生物发酵过程中，补料控制也是影响发酵的一个重要因素。在发酵的进行状态中，微生物生成代谢也会在半连续式发酵过程的变化情况下发生相应的改变。所以，在这过程中，应该连续不断地为生物补充营养成分，保证微生物能够按优生物轨迹生长，才能促进微生物代谢产物产量的提升。
不同于物理、化学反应，生物过程反应速度相对较慢，反应物质、产物浓度等的转化率也不高。若要解决上述问题，工业微生物学通常是从两个方面入手：（1）正确选育或改良菌种，提高发酵菌种的优良性；（2）对培养条件进行合理控制，为生产出更好的目标产物创造条件。从某种程度上看，通过控制与优化发酵过程，能够将生物过程较好地控制在一种优化的操作环境或条件下，被认为是促进生产力提升的有效措施或捷径之一，具有非常重要的意义。因此，在发酵过程中，相关人员必须重视对发酵过程的线检测与控制，力将发酵环境或操作条件控制在一个较理想的状态下，为进一步提升生产水平提供强大的技术支持。
4 微生物发酵过程的优化控制策略
4.1 基于线性化近似的经典优化控制
基于“极大值原理”经典的优化控制方法在早期发酵过程优化控制中应用较为广泛。在发酵过程状态空间描述中利用极大值原理以及迭代法可以实现发酵的最优实施效果。极大值原理方法适用于比较复杂的发酵过程控制对象，但极大值原理只能得到开环控制，当发酵过程中的计算量较大时，仅能对少数过程制定出优化曲线，忽视了环境因素对系统的干扰。相关研究人员后来将极大值原方法融入理变量方法，得到最佳的变量优化曲线，控制效果较好，但是还没有达到理想的实验精度与简便性；发酵过程的建模质量对经典优化控制的发展产生了很大程度的影响。
4.2 基于人工智能技术的优化控制
利用计算机科学技术结合人工智能理论对发酵过程进行优化控制成为近几年的发酵过程研究的热点，人工智能技术能突破很多复杂的系统问题，主要包括专家控制、神经网络控制等。利用智能方法对发酵过程进行优化控制，在研究与仿真中呈现出优良的效果。研究人员建立了基于乙醇生产的专家系统，实现了乙醇发酵过程的发酵单元的检测，系统的误差非常小，系统的稳定性也得到了提高。但智能控制方法在模拟活动时仍存在局限性，神经网络控制对于网格结构的确定具有不可控性，因此智能方法交叉成为目前急需研究的发酵控制的技术问题。
5 结论
随着科技的不断进步以及生物技术水平的持续提升，微生物发酵技术已经得到了非常广泛的发展，除了在农业与工业方面获得了广泛的应用外，其在医药领域的应用更加值得期待。利用微生物发酵技术可以有效地解决许多正常生产不能够解决的难题。合理运用微生物发酵技术，并对发酵工艺进行持续地优化与改进，可以有效地提升生产效率，推动发酵工程技术不断前进与健康发展，从而扩大微生物发酵在各领域的应用价值。？
参考文献
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篇12
很多国外企业想到中国来找市场，同时又有很多中国企业想走出去，如何才能实现双方的互利共赢？以色列TBN集团总裁Sigal女士给出的答案是“合作”。Sigal女士围绕“国家商业发展与中国创新”这一主题，介绍如何建立成功的全球合资企业，创造合作共赢的平台；如何利用独特的中国创新方式进入新市场，以及如何利用国际孵化器资源培育生物技术和生物医药产业。她认为，国际孵化器资源对于中国市场，尤其是有想法、有创意的年轻人而言是一个很好的研发和创新平台。
篇13
Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research
XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.
Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method
土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。
长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1%左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养[2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此，有关微生物多样性研究进展不大。
近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落总DNA的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3]。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组DNA。关于土壤微生物DNA提取方法的报道很多[4，5]，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组DNA的提取方法及其提取效果。另外，细胞裂解不完全、DNA分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、DNA分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物DNA提取的质量，因而提取土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[6]。本文主要对DNA提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。
1 基于DNA方法的土壤微生物多样性研究现状
传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性，并且如果某种微生物的PLFA是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别[7，8]。
1980年，Torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌DNA的方法，并于1990年将其成功应用于DNA杂交技术，研究发现1 g土壤中有4 000个以上不同的细菌种类，说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域，在不同的个体间16S rDNA基因序列也不会进行基因交换，因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识。此后，基于16S rDNA基因的指纹图谱分析的现代分子生物学技术得到迅速发展，包括限制性片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增DNA多态性分析（RAPD）、单链构象多态性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。其总的技术路线：分离微生物基因组DNA，用特异性引物扩增16S rRNA基因片段，再将该PCR扩增产物进行更深一步分析，从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化[10]。
2 土壤微生物总DNA的提取
从土壤样品中提取DNA的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总DNA。直接裂解法是不去除土壤等杂质，而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合，直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放DNA，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，都存在一定的缺陷，要想提取较完整的DNA需要具备以下几个条件： ①土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。②对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌DNA折断。③采集土壤样品后应尽快提取DNA，因为土壤在4 ℃储藏几周就会造成大分子DNA的降解。
2.1 间接提取土壤微生物总DNA
Torsvik等[11]最先报道了从土壤中提取微生物DNA的间接法，包括以下4个步骤：①分散土壤；②土壤微生物的提取（分离细胞与土壤）；③土壤微生物的纯化；④细胞裂解及DNA纯化。
2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内，因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散，或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0.2%焦磷酸钠，其他还有Winogradsky盐溶液、Tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等[26]。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现Chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同，采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放DNA很重要，处理不当会使DNA降解。常用分离提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。
2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1 μg/cm3）远小于土壤矿物质的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。Hopkins等[17]采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌。此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20 μm或30 μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化。
由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基础上提出了分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150 μm）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法，为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等[23]以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。分离提取土壤细菌和真菌的流程如图1所示。
2.1.3 土壤微生物的纯化 目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家Albertsson于20世纪50年代所建立，当时主要用于生物大分子的分离。近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法，该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛[24]。关于其分离机制目前尚不完全清楚，有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异，也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系统和PEG/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同[25]。Smith等[19]研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为4∶1的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层PEG相，土壤残存颗粒将进入下层Dextran相，经4次提取纯化，富集在上层PEG相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层PEG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran两相分离技术（A2PP）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0.1%胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4 ℃下振荡2 h，能较好地分散、纯化土壤细菌。研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌。
2.2 直接提取土壤微生物总DNA
现今的土壤细菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤：①原位细胞裂解；②DNA提取和纯化。
2.2.1 原位细胞裂解 直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合。机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂SDS和SarkosyI、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对DNA的提取效果较好。王啸波等[28]采用PBS缓冲液洗涤土壤样品，结合SDS裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物DNA和RNA，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验，从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等[29]采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，结果表明获得的DNA适合于酶解和PCR扩增要求。
值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的DNA具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法。研究表明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等[30]采用冻融+溶菌酶+SDS方法提取3种芽孢杆菌（G+）DNA，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了DNA，未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到DNA，且冻融处理未对DNA造成大的剪切，提取的DN段还大于23.1 kb。张颖慧等[31]使用优化的CTAB法提取真菌基因组DNA。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少，且得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA，可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等。
2.2.2 DNA提取和纯化 在已报道的DNA提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除DNA样品中的蛋白质和部分RNA，然后对DNA进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。
Lamontagne等[32]研究结果表明PVP能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸杂质、提高DNA纯度的作用。李靖宇等[33]采用氯化钙-SDS-酶法对湿地土壤微生物DNA进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高，能直接满足PCR扩增。李钧敏等[34]用含PVPP的缓冲液预洗DNA样品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于PCR分析的土壤微生物总DNA的提取方法。蔡刘体等[35]采用 SDS-CTAB法提取烟草病圃土壤微生物总DNA，该方法既可达到裂解效果，还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的质量。吴红萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物DNA进行纯化后，可用于PCR扩增，并以细菌16S rDNA基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物总DNA，然后用Sephadex G-200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的DNA。段学军等[38]采用稀释模板及巢式PCR法很好地解决了在DNA提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等[39]将BIO101 Systems公司研制的FastPrep多试管核酸提取系统与相应的Fast DNA SPINKit for Soil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总DNA。
没有哪种单一的纯化步骤可以除去所有污染物，故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。Smalla等[40]将粗提的DNA进行3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾沉淀；③Geneclean纯化。发现经前2步纯化的DNA通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化。
2.2.3 直接法和间接法的比较 研究表明，直接法获得的DNA较多，但不易去除抑制剂，间接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分离的DNA纯度较高，而且间接法得到的细菌量只占总菌群的25%～50%，直接法提得的DNA却可以超过细菌总DNA的60%。因此，要想获得大量DNA，选择直接法较好，当所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染时，可用间接提取法。
直接提取对某些特定样品用特定的操作方法能获得较高的提取效率，但是对有些生物量不高的样品则很难得到足够的环境总DNA用于后续操作，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下采用。间接提取在提取效率上远小于直接提取，但用间接提取法所得到的环境总DNA纯度较高，所有样品能直接用于PCR扩增，并且能更好地体现样品中微生物的多样性，适用于有大量样品的情况。
2.3 DNA的纯度和浓度测定
DNA在260 nm处有吸收峰，腐殖酸在230 nm处有吸收峰，计算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以确定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情况下OD230/OD260比值应在0.4～0.5之间为好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越严重。蛋白质在280 nm处有吸收峰，因此OD260/OD280比值经常被用来指示DNA中蛋白质的污染程度，当OD260/OD280比值为1.8～2.2时，DNA较纯，当受蛋白质或其他杂质污染时，OD260/OD280值则较低[41]。此外，还可采用PCR扩增检测DNA的纯化质量，所用扩增引物见文献[42]。
提取的DNA浓度也可根据测定的OD260值计算，根据公式[dsDNA]=50×OD260×稀释倍数，计算DNA的浓度（μg/mL），换算出每克干土提取DNA的量[43]；还可采用DyNA Quant 200荧光仪对纯化后DNA的浓度进行测定[28]。
3 影响土壤微生物总DNA提取的因子
土壤成分复杂，含有大量的有机及无机等多种生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可能影响土壤DNA的提取质量，抑制DNA聚合酶的活性从而影响土壤微生物多样性的分析。研究发现，腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除的污染物，由于它的分子大小和理化性质与DNA相似，过分注重腐殖酸的去除，势必会造成DNA的大量损失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的难点所在。
各种土壤类型、质地和成分的差异，都会影响土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法从8种土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量为5%～31%不等）中提取DNA，平均获得DNA的量为0.5～26.9 μg/g，并发现获得的DNA量与土壤的有机磷含量有明显的正相关关系。另外，研究也发现，土壤中细菌的裂解效率与其中黏粒的含量呈明显的负相关。土壤中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的顺序为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，细菌在粒径不同的土壤颗粒表面的最大与最小吸附量分别相差389.0和857.0倍，去有机质土壤颗粒对细菌吸附亲和力较含有机质土壤颗粒的大[45]。因此，不同的土壤适合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取过程中，应针对土壤类别选取合适的提取方法，以便进行后续研究。
4 小结
从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注[46]。因而越过分离培养的步骤，直接从土壤中获得总DNA以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总DNA。土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的DNA提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。
间接法提取的微生物DNA纯度较高，提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能地释放，能够代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的DNA质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分DNA的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析。最近，Milko等[47]发现一种Taq DNA聚合酶基因突变型可增加对腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要对基因组DNA进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。
绝大多数直接提取法提取的DN段长度不会超过23 kb，而DNA的某些用途如宏基因组文库构建，需要大片段的DNA，直接提取法对此几乎无能为力。
在DNA提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，DNA直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用[48]。但近年来有研究表明DNA提取的产率高不等同于微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相关研究[49]。这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果。
评价一种土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物DNA；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性。
5 展望
目前，国内外对土壤微生物总DNA提取方法的报道很多，但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取DNA还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。另外，将现代分子生物学技术与传统微生物研究方法结合起来，才能更全面地认识和理解土壤微生物群落多样性及其相应的生态功能。
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